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1、第三章 食用菌菌种制作,菌种的制作是食用菌栽培的前提和重要环节，菌种质量的好坏直接影响栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种才能获得高产和优质的产品，因此生产优良的菌种是食用菌栽培的一个极其重要的环节。,菌种概述,一、菌种的概念,二、菌种类型,（一）级别不同的菌种,1.一级种（母种）,2.二级种（原种）,3.三级种（栽培种）,不可再扩,生产总过程,（二）状态不同的菌种,三、菌种生产程序,第一节 制种条件,制种条件主要包括制种场地，仪器设备和消毒灭菌的药品。为了确保菌种的质量和数量，必须科学地选择和合理布局制种场地，具备必要的仪器设备、用具及消毒灭菌的药品等，才能制备出优质菌种。,一、制种场地,
2、二、主要生产设备,一、制培养基设备 二、灭菌设备 三、接种设备 四、培养设备 五、保藏设备,一、制培养基设备 （一）原料处理设备,切片粉碎两用机,拌料机,装袋机,（二）培养基分装设备,装瓶机,挖瓶机,菌种袋,颈圈,菌种瓶,二、灭菌设备,常压,三、接种设备 （一）接种环境,观察窗,紫外灯,操作孔,接种箱,2.接种室,使一定工作区达到相对无菌、无尘状态的电器,3.超净工作台,要求:前端为导热性好的金属材料,4.接种工具,固 体 菌 种 接 种 枪,液体菌种接种枪,返回本节,四、菌种培养设备,1.培养箱 培养少量菌种的恒温电器（2040）,2.培养室 培养大量菌种的恒温房,五、菌种保藏设备 保藏母种
3、：冰箱（4）左右,基本概念,消毒：只杀死病源菌，未伤及芽孢 防腐：暂时抑制微生物生长 除菌：用冲洗、过滤等机械的方法，除去微生物,三、常用的消毒灭菌药品,化学消毒杀菌剂广泛用于食用菌生产过程中的消毒灭菌，其主要种类有： 1、重金属盐类：如汞、银、铝、锌、铜等。 杀菌机理：是通过与蛋白质结合而引起蛋白质变性。低浓度的重金属对微生物起到抑制或杀死作用。微生物浸在0.10.5 %硝酸银升汞溶液中，几分种就会死亡。 常用0.10.2%升汞溶液对玻璃器皿、非金属器械及用于菌种分离的菌菇、菇木进行表面消毒。 2、氧化剂：如高锰酸钾、过氧化氢、臭氧、漂白粉等。 杀菌作用：通过强烈的氧化作用，破坏微生物的原生
4、质或酶蛋白质结构。,（一）、消毒杀菌剂,3、还原剂：如甲醛，5%的甲醛可杀死细菌芽孢和真菌孢子。 甲醛能与微生物细胞蛋白质的氨基酸结合，引起蛋白质变性。使原生质失去正常活动能力。 4、表面活性剂：如乙醇，75%乙醇的消毒力最强，过高过低消毒效果都差。 常用于接种前手指消毒及不耐热制品的消毒。 5、其它消毒剂：石灰，以4份生石灰加入1份水，即生成熟石灰、并放出热，具有杀菌作用。硫磺，常用于培养室和出菇房等空间熏蒸杀菌。杀菌机理：硫磺粉燃烧后产生二氧化硫，二氧化硫与水作用生成亚硫酸，亚硫酸能夺取菌体细胞中的氧，菌体细胞因脱氧至死。,（二）、表面消毒杀菌,表面消毒常用于菌种的分离材料、接种人员的手、
5、器材、工作台面、墙壁等的杀菌处理，表面消毒剂的种类很多，一般是通过涂抹、喷雾、浸泡、洗刷等方法使用。 1、菌种分离材料的表面消毒：子实体未外露的，用0.1%升汞溶液浸泡1分钟；子实体已外露的种菇材料，只能用75%酒精棉球擦菌盖表面和菌柄，不能浸泡在升汞溶液中。 2、手的表面消毒：先用肥皂洗手，再用12%来苏尔等溶液浸泡2分钟。接种前用之于75%酒精擦手。,3、接种工具的消毒杀菌，先用75%酒精擦拭刀片、镊子、接种铲等工具，然后用酒精灯火焰燃烧。 4、器皿的杀菌：利用高温空气进行干热灭菌，具体方法是：，生产中也常用高压蒸汽灭菌法对器皿进行灭菌。 5、墙壁、台面、菇床的表面消毒：常用25%的漂白粉
6、洗刷接种室、培养室墙壁、地面、床架、用具等。,（三）、室内空间杀菌,接种箱、培养室、出菇房的空间消毒主要采用紫外线杀菌和气体灭菌法，还可辅以空间喷雾的方法，增强杀菌的效果。 1、紫外线杀菌法 适用：一般应用于无菌室、接种箱、超净工作台内的灭菌。只适用于空气和物体表面的消毒。 使用方法：一般照射2030min，可杀死空气中95%的细菌。应该在黑暗中使用紫外线。 杀菌机理：导致菌体细胞内核酸和酶发生光化学变化，而使细胞死亡；紫外线可使空气中的氧气产生臭氧，臭氧也具杀菌作用。,2、气体灭菌法（熏蒸杀菌法） 适用：接种箱、接种室和菇房消毒。 常用药物：40%甲醛溶液、硫磺、菇保一号、科达气雾消毒盒、克
7、霉灵气雾消毒剂。,第二节 母种制作,（一）营养液制作(PDA培养基),1. 准备工作,（1）材料 马铃薯、葡萄糖（或蔗糖）、琼脂、水。 （2）仪器用具及消毒药品 电炉子、铝锅、玻璃棒、漏斗、纱布、止水夹、漏斗架、切菜小刀、切板、1000ml烧杯、捆扎绳、棉花、试管（18mm180mm）、试管架、铁丝筐、1.5cm厚的长木条、标签、天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、牛皮纸、皮筋、纱布、恒温培养箱、手提式高压灭菌锅、超净工作台或接种箱、接种铲、酒精灯、火柴、记号笔等。消毒药品包括：75的酒精棉球、0.25%新洁尔灭溶液、烟雾消毒王或菇保一号等。,一 母种培养基制作,将学生分成几组，分别负责切土豆
8、、称量水、称量药品、处理琼脂等。,2.称量、材料预处理,将切好的马铃薯块加适量水后放入铝锅或电饭锅中，煮至酥而不烂。,3.熬制,4. 过滤、加可溶药物,用双层纱布过滤，取滤汁， 放在铝锅中加入糖。,在沸腾状态下加入琼脂粉，直到琼脂完全溶化为止，定容至1000ml。,5.加琼脂，定容,（二）营养液分装,1. 用注射器或用带止水夹的漏斗分装 2. 分装量为试管长度的1/41/5。注意培养基不能沾污试管口。,9或11支试管捆在一起，棉塞上包好防水纸，直立放入高压灭菌锅中。,棉塞松紧适度，1/3在管外，2/3在管内。,3.塞棉塞,4.捆扎,A 正确 B 不正确,在1.1kg/cm3压力下维持30-40
9、min。,（三）灭菌,灭菌结束后锅盖开1/5的小缝，用余热烘干报纸和 棉塞，然后摆斜面。斜面长是试管总长的1/2,(四) 摆斜面,在严格消毒灭菌条件下进行的操作,无菌操作概念,（一）概念 菌种分离：用无菌操作的方法将所需要的食用菌从混杂的微生物群体中单独分离出来的过程。 （二）关键 严格按无菌操作规程进行 无菌操作：任何一个操作过程都要注意避免把其它任何无关的菌体带入到培养基中。 注意二点： 1严格树立无菌观念； 2严格遵循无菌操作规程。,（三）方法 食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法。,二 菌种分离,（1）概念 将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。 （2）
10、特点： 属于无性繁殖，能保持原有菌株的优良种性，是获得纯菌种的常用方法，且简单易行。 若种菇感染病毒，不易脱毒。,1组织分离法（无性繁殖）,（3）根据切取的组织来源不同，组织分离可分为子实体组织分离、菌核菌索组织分离和机内菌丝分离三种方法。生产上最常用的是子实体组织分离。 子实体组织分离：从食用菌的子实体上切取一块组织，通过分离培养而获得母种的方法。 菌核菌索组织分离：在菌核菌索上切取一块组织，通过分离培养而获得母种的方法。 机内菌丝组织分离：在培养基中直接挑取生长的菌丝，通过分离培养而获得母种的方法。,取大型伞菌子实体菌柄与菌盖交界处 或菌柄上部的菌肉，分离效果最好。,金针菇是横切菌盖上薄的
11、菌肉或取未开伞的幼嫩子实体的菌褶片,灵芝组织分离所取的部位是菌盖边缘的白色生长圈,木耳等胶质菌类的菌肉薄，子实体经无菌水反复冲洗后，撕开子实体或用刀片将两层耳片切开，挑取一小块菌肉组织即可。,操作过程（以子实体组织分离为例）： 种菇选择：选择头潮菇、外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常、尚未散孢、无病虫害、长至七八分成熟的优质单朵菇作种菇。 种菇消毒：0.1%升汞溶液或75%酒精，浸泡或擦拭，无菌水冲洗，吸干表面的水分。 切块接种：将分离种菇沿柄中心纵向掰成两半，用解剖刀在菇盖柄交接处划成田字形，取黄豆大一小块菌肉组织，接在斜面培养基上。 培养纯化：在25下，培养24d长出白色绒毛状菌丝体，
12、当菌丝延伸到基质上后，用接种针挑取菌丝顶端部分，接种到新的斜面培养基上，长满管后即为母种。,2、孢子分离法 孢子是食用菌的有性繁殖单位，能自动从成熟的子实体上弹射出来。 孢子分离法是指在无菌条件下，使食用菌产生的孢子在适宜的培养基上萌发，长成菌丝体而获得纯菌种的方法。,孢子分离分为单孢分离法和多孢分离法两种。 单孢分离法：是在采集到大量孢子的基础上，经过稀释或使用单孢分离器等方法，使孢子之间互相分开，各个孢子单独萌发出菌丝而获得纯菌种的方法，常用于杂交育种和其它研究。 多孢分离法：是将多个孢子接种在同一培养基上，使其萌发，自由交配而获得纯菌种的方法。,孢子分离法的优点 （1）有性孢子具有双亲的
13、遗传特性，变异性大，是选育新菌株和杂交育种的好材料，可供选择优良菌株的机会较多。 （2）孢子的生命力强，所得菌种生活力旺盛。因此，又常被用作菌种复壮的手段。 分离到的菌株要通过出菇试验才能确定其是否好的菌种。,在无菌条件下，可用75%的棉球对种菇进行表面消毒，或用0.1% 的升汞溶液浸1-2分钟，再用无菌水冲洗三次，无菌纱布吸干表面水分。,1.种菇的消毒,2.采收孢子,钩悬法,25、24h现孢子粉 取出分离材料,放入接种箱用于孢子分离的平菇，经过812小时后就有孢子弹出，一般放昼夜培养皿中就有厚厚一层白色孢子印，这时要及时进行接种。一朵菇体弹射的孢子量可接种10支以上试管种，接种完成后贴上标签
14、放入25左右的恒温箱中培养。培养过程中，前34天为孢子定植期，外表看不出任何变化，7天以后孢子开始萌发并在四周长出白色绒毛状菌丝体，1618天左右菌丝布满培养基面，即得纯菌丝母种，如有污染管应及时弃除。,3.接种与培养,多孢分离法,斜面划线法 在无菌条件下，用接种环从采集的孢子上蘸取少量孢子，在试管斜面上自下而上划线，待孢子萌发长出菌丝后自由结合，挑选长势好的转接，培养既得纯菌种。,三、母种的转接 母种转接，也称转管、母种的继代培养。 由于分离或引进的原始母种数量有限，不能满足生产所需，因此，需进行扩大培养，通常原始母种允许扩大转接次。 母种的转管次数不宜过多，否则会降低菌种的生活力，影响栽培
15、效果。不具备条件和技术的部门不应扩接母种。,1.将接种用品及原始母种放入接种箱内。 2.用气雾消毒盒（4g/m3）进行密闭熏蒸30min以上。 3.手、台面、接种工具、母种管用酒精棉球擦试消毒。 4.点燃酒精灯，火焰灼烧接种镐至烧红后冷却，凡能伸进试管的杆部均过火灭菌。,(一)母种转管无菌操作技术要点,6右手小指、无名指及手掌拔掉棉塞，用火焰灼烧试管口并不断搅动。,5.将母种和空白斜面培养基用大拇指和其他四指握在左手中，斜面向上，并使它们与桌面接近水平，试管口略向下倾斜。,7先弃去前端1cm处，然后用接种镐快速移取黄豆粒大小的菌种入待接试管斜面培养基中央。,8抽出接种钩，烧灼管口，棉塞燎烤至微
16、焦，在火焰旁塞上棉塞。 9用接种镐挑持住母种管，另一只手换待接管，重复上述操作。,10.收拾台面。 11.贴标签,接种后，于22左右的环境避光培养，每天 都有要仔细观察，对污染的试管及时挑除。原始 母种的培养初期一定要天天检查，以免菌丝将污 染处盖住，难以挑出，造成损失。 一般7-10d左右可以长满管。长满管后，一部分用于扩繁，另一部分用于保存。于+5的水箱冷藏层中至少可以保存2个月。,（二）母种培养,母种的转接,（三）母种鉴定： 洁白，健壮，无虫害，有蘑菇香味,优质母种的一般标准 菌种纯正，无杂菌污染。 菌丝洁白浓密，气生菌丝量多。 菌丝不老化变色，培养基不萎缩失水。 菌龄要适宜，一般室温保藏不超过15d，4下冷藏不超过3个月。,
