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1、第三章 酶的筛选,一、酶的来源与多样性 可以通过两条途径 1化学合成，包括酶的化学全合成、模拟酶的 化学合成。 2生物合成，从生物中提制。 少数来自于动植物，多数（80%以上）来源于微生物；,微生物作为酶源的优点： (1)种类繁多，易筛选：凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找到并可根据应用特点和要求，筛选出最佳的产酶菌株； (2)繁殖快，发酵周期短，培养简便，能通过控制培养条件大幅度提高酶的产量； (3)微生物具有较强的适应能力，可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想菌株。,微生物多样性赋予的酶开发的巨大开发潜力,1)不可培养微生物：指在实验室内,采用常规培养方法培养不出的微生物。（占
2、全部微生物的99%） 绕开菌种分离、纯化的步骤，应用分子生物学方法，直接从中寻找有开发价值的、新的微生物酶基因和新的酶种。,2)嗜极端环境微生物 嗜热微生物（250350）； 嗜冷微生物（-100）； 嗜酸微生物（p0）； 嗜碱微生物(p11)； 嗜盐微生物饱和食盐溶液（含盐32%或 5 2mol/）； 耐有机溶剂微生物,二、酶的寻找和发现 1. 反应过程的设计 选择合适的合成的反应途径、反应底物或原料 底物：价廉、易合成 酶：是否易得、活性、稳定性。 资料查阅：是否有已确定的能转化该反应的或相似反应的酶。,氨基酸生物合成的多条途径,brenda (http:/www.brenda.uni-k
3、oeln.de/) 大量关于酶的信息：包括酶的分类，序列、结构、功能、特性（稳定性、最佳pH、最佳反应温度）、底物产物、催化的反应，代谢途径，抑制剂、激活剂，辅助因子等 Ligand 数据库http:/www.genome.ad.jp/ligand/ 包含了化合物（除常规代谢途径的化合物外还包括其他化合物、如：药物、多糖）、酶、反应。 Biocatalysis/biodegradation http:/umbbd.ahc.umn.edu 代谢途径和生物转化，主要包含代谢途径、反应、化合物、酶。,2. 酶的寻找,获得新酶的方法 筛选新酶：从自然环境中； 发现现有酶的新活力（非自然）； 利用新的反
4、应条件，如改变反介质，或新的影响因素（如金属离子）； 酶的改造，主要指利用基因工程技术，突变酶,定向进化； 人工酶。,脂肪酶的催化混杂性,脂肪酶的催化混杂性,3.酶或产酶微生物的筛选,（1）从商品酶库中筛选 （2）从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选 （3）从自然界发现和筛选产酶微生物 （4）从基因库筛选,从自然界筛选产酶微生物一般步骤：,1.采样：生物多样性环境；高选择压力环境（针对与工艺条件相似的环境）。 2.富集培养：取其所好，投其所抗。 3. 分离：稀释涂布、划线分离。 4.筛选 初筛：最普通的筛子快速简单，筛去大部分非目标株，尽量保留有潜力的候选株。,1）琼脂板涂布法 筛子： 以底物或底
5、物类似物为唯一的碳、氮原 ； 底物的转化或产物的形成在琼脂培养皿上产生的半透明圈。 产物的衍生化或络合：衍生化或络合试剂与产物的某些功能团形成呈色圈。 色原性底物：通过酶催化时颜色的变化,对菌群进行可视的直接鉴定。 指示菌株：对产物能显示某种生理变化，如生长、或不生长。,水解酶活性检测中最常用的色原性底物-对硝基苯基衍生物 脂肪酶对硝基苯酯 蛋白酶对硝基苯酰胺 糖苷酶对硝基苯糖苷,对硝基苯糖苷,水解释放黄色对硝基苯酚或苯胺,其他常用的发光底物 试卤灵（resorufin）,1-萘酚衍生物。 荧光底物-伞形酮（umbelliferone）作为内置荧光团的衍生物 缺点：只能模拟目标真实底物。,氧化
6、还原酶活性检测 基于NAD(P)H生成的比色法 NAD(P)H在340nm的吸光度可用于检测信号。 间接法：四唑氮蓝（NBT）/吩嗪硫酸甲酯（PMS）法，在PMS存在下，NAD(P)H与黄色的 NBT反应，可生成蓝紫色甲臜（formazan），吸收波长：580nm。,过氧化物酶 ABTS(2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)检测法 ABTS可被过氧化物酶氧化呈浓绿色 邻联茴香胺-氧化呈红色。,2） 微孔板悬浮法 需有吸光度的变化，可见，或荧光。 3）微珠细胞固定化法 Freeman等人设计的微珠固定化方法,通过物理手段使单个细胞附着在单个聚丙烯酰胺固体。 .4）流式
7、细胞计数法 细胞通过高速流动系统, 排成单行,逐个流经检测区进行。,复筛：特定筛慢、精确。使用准确的定量分析方法，确定反应速率、选择性等。（液、气相色谱、分光光度法等） 毛细管电泳法，质谱法，红外热成像法，酶法检测，酶联免疫等多种现代分析方法逐渐应用于酶尤其是酶立体选择性的筛选。,5生产菌的改良 诱变、定向突变；代谢调控。,4）从基因库筛选 分子筛选(molecular screening) 基于序列(sequence-based)的筛选。 数据库挖掘（Database mining） 基于序列的同源性，从已知酶基因（蛋白）出发，搜索数据库。,PCR筛选 根据已知酶蛋白，设计兼并引物，PCR克
8、隆，表达，活性检测。 基于cDNA文库和基因组库的筛选 根据已知酶蛋白，设计兼并引物，PCR克隆(Southern 杂交)，表达，活性检测。,宏基因组（metagenome)法 宏基因组是特定小生境中全部微小生物遗传物质的总和。 土样分离收集DNA片断限制酶剪切PCR扩增克隆到载体内转化（大肠杆菌）筛选转化株功能基因新酶。,重点： 1.产酶微生物筛选的基本流程 2.筛选过程中筛子的设计 关注： 酶的分子筛选 1. Genomic Data Mining: An Efficient Way to Find New and Better Enzymes 2. Sequence- and activity-based screening of microbial genomes for novel dehalogenases,
