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1、微生物的选育培养和保藏,第二章 生产菌种的选育及发酵培养基设计,2.5 发酵培养基的设计,2.4 菌种的扩大培养及保藏,2.3 生物菌种的选育方法,2.2 微生物代谢控制育种的措施,2.1 微生物的代谢及调控,2.6 生产实例-谷氨酸菌种培养,第二章 生产菌种的选育及发酵培养基设计,2.5 发酵培养基的设计,2.4 菌种的扩大培养及保藏,2.3 生物菌种的选育方法,2.2 微生物代谢控制育种的措施,2.1 微生物的代谢及调控,2.6 生产实例-谷氨酸菌种培养,核心、重点掌握,一、菌种的选育,优良的菌种是发酵工业的基础和关键所在，是发酵工业的“灵魂”。 菌种选育目的：改良菌种的生理特性和生产性能
2、，获得优良的菌种，并使其适合发酵工业生产的需要。,一、菌种的选育,发酵工业常用微生物 新菌种的一般分离筛选 菌种改良及工程菌构建,工业常见微生物种类,工业菌种获取方式,工业生产对菌种的基本要求,菌种改良概念、意义,菌种改良的理论基础,菌种改良的方式,一、菌种的选育,发酵工业常用微生物 新菌种的分离筛选方法 菌种改良及工程菌构建,工业常见微生物种类,工业菌种获取方式,工业生产对菌种的基本要求,菌种改良概念、意义,菌种改良的理论基础,菌种改良的方式,放线菌 担子菌 藻类,细菌 酵母菌 霉菌,工业常见微生物种类,细菌,大肠杆菌在发酵工业中常用于生产氨基酸、工业燃料 乳酸菌在发酵工业中常用于生产陈醋、
3、酸奶、乳酸钙 枯草芽孢杆菌在发酵工业中常用于可用于生产淀粉酶、蛋白酶、某些氨基酸、叶酸、肌苷、鸟苷、维生素B2,大肠杆菌,乳酸菌,枯草芽孢杆菌,酵母菌,茶酵母、酿酒酵母、面包酵母 酿酒酵母是与人类关系最密切的一种酵母。,霉 菌,毛霉 产生蛋白酶、有分解大豆蛋白 的能力。腐乳、蛋白的生产。,曲霉 各类酶制剂、有机酸、酱油的 制造、酿酒 根霉 米酒、黄酒的生产,放线菌,抗生素的生产,链霉菌、小单孢菌、诺卡菌,担子菌,通常所说的菇类(mushroom)微生物。 多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发,藻 类,藻类是自然界分布极广的一类自养微生物资源 藻类培养后可加工成汽油、煤油和 其他产品,工业化菌种的要求
4、,核心要求,安全,便利,经济,菌种自我保护，不易被它种微生物或噬菌体侵染,菌种非病原菌，保证产品非毒性,菌种要纯粹，即遗传稳定，不易退化 。,发酵工艺温和易控制,生长速度和反应速度快，发酵周期短,菌种单产量高,能够利用廉价原料、产品产量产率高且易回收,常用菌种的获取方式,1、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)-国内常用 http:/www.china-cicc.org 2、国际菌种保藏联合会(WFCC)-权威机构、服务广泛 http:/www.wfcc.info/ 3、美国典型微生物菌种保藏中心 (ATCC)-非盈利、门类齐全 http:/www.atcc.org/ 4、中国科学院典型
5、培养物保藏委员会(CTCC-CAS)-侧重科学研究 http:/ 菌种的分离筛选方法 菌种改良及工程菌构建,工业常见微生物种类,工业菌种获取方式,工业生产对菌种的基本要求,菌种改良概念、意义,菌种改良的理论基础,菌种改良的方式,菌种的分离筛选方法,定方案样品采集样品的预处理菌种富集培养初筛复筛发酵性能鉴定获得目的菌。,设计筛选方案特别注意的是采用方法的选择性和灵敏度； 简洁而有效的筛选方法是育种工作的关键。,生物菌种的选育方法,发酵工业常用微生物 新菌种的分离筛选方法 菌种改良及工程菌构建,工业常见微生物种类,工业菌种获取方式,工业生产对菌种的基本要求,菌种改良概念、意义,菌种改良的理论基础,
6、菌种改良的方式,菌种的改良概念、意义及理论基础,菌种改良：采用各种手段（物理、化学、工程学、生物学方法以及它们的各自组合）处理目的微生物菌种，使其遗传基因发生变化，使生物合成朝人们希望的方向加以引导，某些代谢产物过量积累，从而获得生产上所需要的高产、优质和低耗的变异菌种。 菌种改良的意义：通过菌种改良，可以提高发酵产物的产量和纯度，减少副产物的生成；通过菌种改良还可以改变菌种生物合成途径，从而获得新的产品。 菌种改良的理论基础是基因突变 自然状态下，微生物本身的自发突变频率极低10-810-5 人为诱变处理，可以大幅度提高微生物的突变频率至10-610-3 目前菌种改良已成为获得优质菌种的主要
7、获得途径。,2.3 生物菌种的选育方法,菌种改良的方法,自然选育 诱变选育 杂交选育 原生质体融合育种 基因工程育种,菌种改良的方法,自然选育：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程。（正向突变-性能提高；负向突变性能降低）-效率较低 诱变选育：诱变育种是指用物理和化学诱变剂的方法处理均匀分散的细胞群，使它们发生突变，从中筛选出符合要求的高产菌株。（选择出发菌诱变处理筛选变异菌）-广泛使用的育种方法（紫外线、X-射线、-射线、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍） 杂交选育：两个基因型不同的菌株经接合后使遗传物质重新组合，从中分离筛选出具有新性状菌株的一种育种技术
8、。-较诱变育种具有更强的方向性和目的性，且能改善长期诱变菌种产量提升过慢的现象（接合的概念是指性状不同两种微生物之间接触，通过遗传物质转移、交换、重组形成新个体。） 原生质体融合育种：用水解酶除去细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经过染色体交换、重组而达到杂交的目的。 基因工程育种：采用基因工程技术将多种微生物的基因从细胞中取出，然后有选择的拼接组装到一个细胞中，使这个菌株具有多功能、高效和适应性强等特点的新型微生物。-新兴的育种方法，还不能完全取代诱变育种,基因工程育种经典案例,2.3 生物菌种的选育方法,首例基因遗传改
9、造大肠杆菌生产抗疟疾药物青蒿酸,Vincent JJ Martin et al. VOLUME 21 NUMBER 7 JULY 2003 Nature biotechnology,Keasling课题组基因遗传改造大肠杆菌生产抗疟疾药物青蒿素前体物青蒿酸，产量从无到有大幅度提高，并可用于工业化生产,二、菌种的扩大培养和保藏,菌种的扩大培养 菌种的衰退与复壮 菌种的保藏,二、菌种的扩大培养和保藏,菌种的扩大培养 菌种的衰退与复壮 菌种的保藏,菌种的扩大培养,菌种的扩大培养概念：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量
10、的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 扩大培养的重要性：在扩大培养过程中,种子的质量优劣对发酵起着至关重要的作用。根据菌种生理特性，选择合适培养条件获得的代谢旺盛、数量足够的种子，能够使发酵生产周期缩短，提高设备利用率。,菌种的扩大培养,投入发酵生产前的扩大培养两阶段： 实验室种子制备、车间种子罐制备 实验室种子制备阶段： 孢子制备、摇瓶种子制备 生产车间种子罐制备阶段： 按照发酵罐大小，种子罐设置n级放大； 注意两参数种龄（对数中后期）和接种量（细菌1%；霉菌10%）,二、菌种的扩大培养和保藏,菌种的扩大培养 菌种的衰退与复壮 菌种的保藏,菌种的衰退和复壮,菌种的衰退概念：又叫做菌种的退化，
11、是指生产菌种或者筛选出来的优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体某些形态特征及生理特征逐渐减退或者完全丧失的现象，这是一种群体概念。菌种退化过程是一个从量变到质变的过程。,菌种为何会退化？,菌种的衰退和复壮,菌种衰退原因,基因负向突变、细胞内功能质粒丢失衰退的根本原因,变异菌株性状分离多核细胞最常见，或DNA单链上含突变,连续传代单个退化细胞连续传代富集使变异性状明显,其他因素如温度、pH、培养基成分及条件引起菌种基因突变,例如营养缺陷型突变株发生回复突变使产量下降：黏质赛氏杆菌H-2892原产18 g/l His，经5次传代因回复突变型增多，产量下降至4 g/l ；如携带游离质粒枯草芽孢
12、杆菌生产2,3-丁二醇，经无抗条件下连续传代，产2,3-丁二醇能力下降。,菌种的衰退和复壮,菌种的提纯和复壮概念：从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供生产和科研使用。 狭义的复壮：仅是指在菌种已发生衰退的情况下通过纯化分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退群体中筛选出少数尚未退化的个体，达到恢复原菌株固有特性的相应措施。 广义的复壮：是一项积极地措施，是指在菌种的典型特性或生产性状尚未衰退前，就经常有意识的采取纯种分离和生产性状的测定工作。以期从中筛选到自发的正突变个体。,菌种主要复壮方式,菌种提纯（梯度浓度稀释涂布、划线法
13、、单胞分离法等）,通过寄生体复壮（反复感染法）,淘汰已衰退的个体（物理、化学方法处理）,二、菌种的扩大培养和保藏,菌种的扩大培养 菌种的衰退与复壮 菌种的保藏,斜面低温保藏法,液体石蜡油保藏法,液氮超低温保藏法,砂土管保藏法,真空冷冻干燥法,（5种经典方法）,菌种的保藏,斜面低温保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 培养 4保藏 适用：各大类菌种 保藏期：1-3个月 优点：方法简单易于推广 缺点：不宜长时间保存，菌种易退化、污染,液体石蜡油保藏法 方法：斜面或半固体接种 培养 加无菌液蜡高出培养基1cm 415保藏 适用于酵母、霉菌和好氧性细菌的保藏 保藏期限一般为2-3年 优点：方法简单、对设备
14、要求不高 缺点：不适用于利用石蜡或对石蜡敏感的微生物保藏,菌种的保藏,菌种的保藏,液氮超低温保藏法 方法：菌种培养 保护剂悬浮 加入保藏管中 置液氮瓶中 适用于各类微生物的保藏 保藏期限4-15年 优点：方法简单、对设备要求不高,砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥封口 保藏 适用于保藏干燥的菌种，尤其产芽孢微生物 保藏时间因菌种而异 优点：简单易行， 缺点：工作量大、费人力,菌种的保藏,真空冷冻干燥法 方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安瓿管中低温冻结（-18）抽真空（至0.01 mmHg） 真空封口 检查真空度 保藏 适用于各类微生物 时间长达5年以上 优点：该法存活率高、不易变异 缺点：操作复杂、要求严格、需一定设备条件,菌种的保藏,本节课重点内容,工业常用的菌种有哪几类？ 工业菌种一般通过什么方式获取？ 菌种的一般分离纯化和筛选步骤是什么？ 菌种的选育方式有哪几种？ 菌种衰退的原因及复壮的方法是什么？ 常见的菌种保藏方式有哪几种？,
