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1、1,第七章,酶工程制药,2,本章主要内容,第一节 概述 第二节 酶的来源和生产 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 酶工程在医药工业中的应用 第五节 酶工程研究进展,3,第一节 概述,一、酶的特性 酶(enzyme)是由生物体活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质，也被称为生物催化剂。 多数酶的本质是蛋白质，有些酶是核酸。 酶作为生物催化剂的，除具有一般催化剂的特性：加快反应速度、降低反应活化能、不改变反应平衡点、反应前后无数量和性质变化等。,4,还具有独有的特点： 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性易受调节和控制,5,二、酶工程简介,是酶学和工程学相互渗透、发展而形成的一门新的技术
2、科学。 从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,6,第二节 酶的来源和生产,一、酶的来源 普遍存在于生物体中，可直接从生物体中分离。化学合成方法目前还不成熟。早期是以动植物为原料进行提取，由于动植物生长周期长、来源有限、受地理、气候和季节等因素的影响，不适于大规模生产，利用微生物来生产酶制品是一个更好的选择。,7,利用微生物来生产酶制品优点,1、微生物种类繁多，动植物体内的酶在微生物中几乎都可以找到； 2、繁殖快、生产周期短 3、培养简便、并可以通过控制培养条件来提高产量； 4、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异手段能培育出新的高产菌株
3、。,8,二、酶的生产菌,1、对菌种的要求 产酶量高，酶的性能符合使用要求，最好是胞外酶； 不是致病菌、在系统发育上与病源体无关，不产生毒素； 稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体； 生产成本低,能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养。,9,2、生产菌来源,菌种保藏机构、有关研究部门； 从自然界中分离筛选，土壤、深海、温泉、火山、森林都是菌种采集地，筛选包括菌样采集、菌种分离、初筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。,10,3、常用产酶微生物,大肠杆菌（最常用的产酶微生物）： 一般属于胞内酶，需要经过细胞破碎才能得到。谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或-氨基丁酸；天冬氨酸酶，催化延胡索酸加氨生成L-天冬氨酸
4、；苄青霉素酰化酶，生成新的半合成青霉素或头孢霉素；-半乳糖苷酶，用于分解乳糖。,11,枯草杆菌：-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。 青霉菌：产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用于生产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶。,12,黑曲霉：有胞外酶和胞内酶，糖化酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶。 米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。 木霉：纤维素酶，含有较强的17-羟化酶，常用于甾体转化。,13,根霉：糖化酶、-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，含有较强的11-羟化酶，常用于甾体转化。 链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素
5、酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，含有丰富的11-羟化酶，可用于甾体转化。,14,啤酒酵母：酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。可生产转化酶、丙酮酸脱羧酶等的生产。,15,三、提高药用酶产量的措施,1、添加诱导物 2、控制阻遏物浓度 3、添加表面活性剂 4、添加产酶促进剂,16,1、添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶。 诱导物可分为三种：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物。,17,有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用，应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。,2、控制阻遏物浓度,18,3、添加表面
6、活性剂,可分为离子型和非离子型，离子型对细胞有毒害作用，只能使用非离子型，可聚集在细胞膜上，增加细胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的产量。,19,4、添加产酶促进剂,植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1-20倍。,20,第三节 酶和细胞的固定化,使用纯酶的缺点：只能使用一次，成本高，产品分离困难；酶溶液很不稳定，容易变性和失活。 固定化酶的优点：性能稳定；可反复使用，降低了成本，易与产品分离，简化下游操作。,21,一、固定化酶的制备,1、定义 限制或固定于特定空间位置的酶，即经物理化学方法处理，使酶变成不易随水流失、运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。,22,2、固定化
7、酶的特点 （1）、可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高；（2）、反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高；（3）、反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）、酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；（5）、比水溶性酶更适合于多酶反应。,23,第四节 酶工程在医药工业中的应用,酶工程的优点是工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好、还可制造出化学方法无法生产的产品。,24,一、酶在疾病预防和治疗方面的应用,1、蛋白酶 临床上使用最早、用途最广的药用酶之一。 消化剂，用于治疗消化不良和食欲不振，使用时常常与淀粉酶
8、、脂肪酶等一起制成复合酶制剂，以增加疗效，片剂，可口服。,25,消炎剂，对各种炎症有很好的疗效，它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出并抑制肉芽的形成，可口服、外敷和肌肉注射。,26,蛋白酶经组织注射可治疗高血压，由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原的部分肽段水解生成运动迟缓素和胰血管舒张素，从而使血压下降。,27,2、-淀粉酶 消化药。 3、脂肪酶 消化剂。 假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病。,28,4、右旋糖苷酶,水解右旋糖苷生产小分子产物，对龋齿有显著的预防作用，可加到牙
9、膏和淑口水中。,29,抗菌、消炎、镇痛作用，作用于细胞壁，使其受到破坏，而使病原菌、腐败性细菌等溶解死亡。,5、溶菌酶,30,6、超氧化物歧化酶,抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护机体的DNA、蛋白质和细胞膜免受超氧负离子的破坏。对红斑狼疮、皮肤炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、氧中毒等疾病有显著疗效，对辐射有防护作用。,31,治疗乳糖缺乏症，有些人或婴儿肠道中缺乏乳糖酶，饮用含有乳糖的牛奶等食品时，由于不能分解乳糖，在肠道中，乳糖会因为细菌分解而产生有机酸，刺激肠道引起呕吐。,7、乳糖酶,32,8、链激酶 可催化纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶，将纤维蛋白水解，使血栓溶解。 9、尿激酶 溶解血栓。,
10、33,二、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,青霉素G经青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸（6-APA），也称无侧链青霉素。它是生产半合成青霉素的最基本原料。,34,6-氨基青霉烷酸 （6-APA）,35,技术路线,产青霉素酰化酶,36,第五节 酶工程研究进展,包括酶的修饰、酶的人工模拟、有机相的酶反应和基因工程酶的构建。,37,一、酶的化学修饰,1、目的和意义 天然酶的缺陷：易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限
11、制了酶制剂的应用。,38,酶的化学修饰：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。,39,目的：提高酶的稳定性、降低或消除酶分子的免疫原性（医药）。 意义:扩大了酶制剂的应用范围，同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段。,40,2、常用化学修饰剂,要求： 较大相对分子量； 良好的生物相容性和水溶性； 分子表面有较多的反应活性基团；修饰后酶的半衰期较长。,41,常用修饰剂,糖及糖的衍生物：右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳； 高分子多聚物：聚乙二醇，聚乙烯醇；
12、生物大分子：肝素，血浆蛋白质，聚氨基酸； 双功能试剂：戊二醛，二胺； 其他：固定化酶载体，糖基化试剂，甲基化试剂，乙基化试剂和小分子有机化合物。,42,3、修饰方法,（1）、修饰酶的功能基团 酶分子中可解离的基团如氨基、羟基、羧基、巯基等都可以修饰。如脱氨基可消除酶分子表面氨基酸的电荷；通过碳二亚胺反应，可以改变侧链羧基的性质；通过酰化反应可改变侧链羟基的性质。,43,（2）、酶分子内或分子间进行交联，应用某些双功能试剂可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内部不同肽链部分进行共价交联。,44,（3）修饰酶的辅因子，可将辅因子共价结合在酶分子上，或引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子。 （4）、
13、酶与高分子化合物结合，蛋白质或多糖结合后可提高稳定性。,45,4、修饰酶的特性,稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶化学性质改变，对组织分布能力改变。,46,5、前景,酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可以克服了，并且修饰的结果难以预测，今后，应选用更多的、合适的修饰方法，如使用基因工程法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰法等，使酶的性质进一步改善。,47,二、有机相的酶反应,有机相酶反应指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。 这是一种在极端条件（逆性环境）下进行的酶反应，它可以改变某些酶的性质。,48,有机相酶反应的优点：
14、增加疏水性底物或产物的溶解度；热力学平衡向合成方向移动；可抑制有水参与的副反应；酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用；容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；酶的热稳定性提高，酸度适用范围扩大；无微生物污染；能测定某些在水介质中不能测定的常数；固定化酶方法简单，可以只沉淀在载体表面。,49,有机相酶反应的溶剂体系 水-水溶性溶剂均相体系；水-水不溶性溶剂两相体系；单相有机溶剂体系。 有机相的酶工程 但在有机相中，天然酶容易变性而失活、分散性差、容易聚结成团。固定化酶，酶的化学修饰和表面活性剂包埋。,50,三、基因工程酶的构建,1、酶基因的克隆和表达 重组DNA技术克隆各种天然酶的基因，在微生物中表达，筛选出高产菌株，可以通过发酵大量生产所需要的酶。,51,2、酶基因的遗传修饰 人为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或更换，从而改变酶蛋白分子中某个或几个氨基酸，不仅改变酶的结构，而且改变酶的催化活力，专一性及稳定性。,
