《氨基丁酸（gaba）课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氨基丁酸（gaba）课件（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、-氨基丁酸（GABA）的分布及测定方法,周青 2110805057 生物化工 导师：汪钊教授,目录,分布 -氨基丁酸（GABA）含量的测定方法 薄层色谱 纸电泳法 纸层析法 比色法 氨基酸分析仪测定 毛细管电泳-电化学检测 高效液相色谱法 归纳和总结,分布,在动物体内，GABA主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量很少。在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类似脯氨酸的环状结构。高等植物组织中GABA含量通常在0.332.5molg之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量。,表一 富含GABA植物
2、,返回,方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。分别吸取5l -氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液，点于自制的硅胶薄层板上， 以正丁醇：醋酸：水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干，用体积分数0.2茚三酮乙醇溶液显色，105烘数分钟，直至获最大斑点，用Camag TLC scanner 3 扫描仪扫描。扫描条件为：反射式双波长锯齿扫描,扫描波长S=515nm,参比波长R=680nm，狭缝500.45 mm。,薄层色谱,纸电泳法,方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液吡啶：冰醋酸：蒸馏水(体积比)=
3、2：2：121，pH4.7。电泳完毕后取出电泳纸，水平摆放，室温下自然晾干，再在80电烘箱中风干。用喷雾法向电泳纸上均匀喷洒显色剂，于电热恒温干燥箱中90烘10 min，即显出在有氨基酸区域呈紫红斑点的层析图谱。将与GABA标准品位置一致的斑点剪下，加4ml洗脱液洗脱液V(0.1硫酸铜溶液):V(75乙醇溶液)=1:19洗脱90min，在520nm波长处比色测定洗脱液的吸光度。,纸层析法,方法：展开剂V(正丁醇)：V(醋酸)：V(水)=4：1：3，茚三酮溶解于展开剂中，质量浓度为0.4g/L，在展开过程中，茚三酮随着展开剂沿滤纸向上移动。点样后的滤纸条在展开剂中展开、风干显色，将与标准品位置一
4、致的斑点剪下，用洗脱液V(1 gL硫酸铜)：V(体积分数75%乙醇)=2：38洗脱，520nm处比色测定。,比色法,方法：先做GABA标准曲线：取不同浓度的GABA标准液0.4ml，加0.2molL(pH 9.0)硼酸盐缓冲液0.6 mL，摇匀，加5%苯酚溶液2mL，摇匀，加质量分数6%次氯酸钠溶液1mL，摇匀，放人沸水浴加热5min，立即置冰浴中5min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL60酒精，进行波谱扫描，在最大吸收峰处测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，GABA的含量为横坐标，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法测吸光度，求出样品中GABA的含量。,氨基酸分析仪测定,方法：以日立83
5、530型氨基酸分析仪为例，先按仪器说明配制缓冲溶液及茚三酮溶液，标准GABA溶液用0.02molL盐酸配制成不同浓度，测得峰面积，绘制标准曲线。把处理的样品按以上方法峰面积，求出样品中GABA的含量。,张华和何轶通过此方法测得南瓜中GABA含量为2.956%和沙棘果汁GABA含量为13.4mg/100ml。Chen和Komatsuzaki也采用氨基酸分析仪检测发酵牛奶中GABA含量和发芽糙米经过浸泡和厌氧处理后GABA含量，结果显示用乳酸菌发酵的牛奶和发芽糙米处理后GABA含量为80.6mg/ 100g 和24.9 mg/100 g。,毛细管电泳-电化学检测,该方法使用比较少。孔令瑶用亚硫酸钠
6、替代硫醇试剂使GABA与OPA反应，生成稳定具有电化学活性的衍生物，然后采用毛细管电泳-电化学检测(CEED)法测定发芽黑米胚芽中GABA的含量。他以自制碳圆盘电极为工作电极，以50mmolL的硼砂-硼酸缓冲液为运行缓冲液，采用电动进样，检测池为阴极电泳槽。,高效液相色谱法,-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生 -氨基丁酸与2，4-二硝基氟苯（FDNB）衍生 -氨基丁酸与异硫氰酸苯酯(PITC)衍生 -氨基丁酸与6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）衍生,返回目录,-氨基丁酸与邻苯二甲醛(OPA)衍生,衍生剂的配制：称取10mgOPA，加0.5ml甲醇溶解后，加入2ml 0.4m
7、olL硼酸盐缓冲液(pH9.4)和30l 2-巯基乙醇，此衍生剂溶液可保持2d。 样品衍生：取样品或标准溶液10l，加入上述溶液100l， 混匀，反应1min后进样。,葛菁萍利用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法定量测定短乳杆菌发酵液中-氨基丁酸含量，利用C18色谱柱，以50mmolL的乙酸钠(pH6.8)-甲醇-四氢呋喃(A相，82：17：1；B相，22：77：1，V/V)为流动相进行梯度洗脱，可以检测到痕量-氨基丁酸(22mg100g)。,-氨基丁酸与2，4-二硝基氟苯（FDNB）衍生,样品衍生化及预处理：以1FDNB的乙腈溶液作为衍生剂，取配制好的标准GABA溶液或待测样品1mL置于10m
8、L棕色量瓶中，加入0.5molL NaHCO3 (pH=9.0)溶液1mL，再加入12，4-二硝基氟苯的乙腈溶液1mL，置于60水浴中暗处加热1h后取出，冷却，添加pH=7.0的磷酸盐缓冲液至刻度，混匀，过0.45m滤膜。不用时样品于4下避光保存。,孟祥勇采用2，4二硝基氟苯柱前衍生法测定发芽前后糙米中GABA的含量，结果显示：糙米中的-氨基丁酸由5.01 mg100g提高到35.03mg100g。,-氨基丁酸与异硫氰酸苯酯(PITC)衍生,归纳有两种不同的衍生方法： 方法一： 样品衍生化：精密量取供试品贮备液适量(80400l)，置1mL量瓶中，加异硫氰酸苯酯乙腈溶液(25l:2mL)200
9、l，加三乙胺乙腈溶液(1.4:8.6)稀释至刻度，摇匀，放置1 h，转移至试管中，加正己烷1mL，振摇，分取下层液体，滤过，取续滤液作为待测溶液。,陈文琼等人用此方法，利用VenusilAA氨基酸分析柱(250mm 4.6mm，5m)，用二元梯度洗脱，流动相A为0.05molL醋酸钠溶液(pH=65)，流动相B为乙腈-水(80：20)，检测波长为248nm，得到-氨基丁酸的检测浓度在2.05612.336g/ L范围内与峰面积积分值呈较好的线性关系。Barcina和Kuo等人也用此方法检测奶酪和豆类中氨基酸含量，发现有GABA存在。,方法二： 衍生试剂：异硫氰酸苯酯(PITC)：甲醇：乙醇：三
10、乙胺：水= l：6：l：l：l(v：v：v：v：v)；需新鲜配制。 样品衍生：取GABA标准液或样品液20l 注入玻璃试管中，冷冻干燥，然后加入干燥液10l【甲醇：1.0molL醋酸钠：三乙胺= 2：2：l (v：v：v)】，再一次冻干，再加入20l衍生化试剂，室温衍生20min后经冻干置冰箱4保存。10l进样。,陈海军用异硫氰酸苯酯柱前衍生，紫外检测发酵液中GABA浓度，在254nm处有最大吸收峰。杨胜远采用7%(VV)乙酸水溶液对发酵醪进行预处理，以异硫氰酸苯酯为衍生剂，用反相C18柱为分离柱，柱温27，阶段洗脱，在254nm下进行检测。结果表明，发酵醪中的GABA获得了很好的分离，GAB
11、A在01.5 mmolL内线性相关性好，其线性方程为:y=141065713x-258.2493(r=0.9993)。,-氨基丁酸与6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）衍生,样品衍生化：取10l样品液至干净的样品管底部，吸取7l硼酸盐缓冲液(pH8.8)至样品管中，短暂涡旋混合，再吸取20l AQC衍生试剂至样品管中，混匀15s,室温放置1min；用石蜡膜封口，置55烘箱内加热l0min，取出转移置样品管中，10l进样。,Chung等人用AQC柱前衍生，检测发芽谷物中GABA含量，实验发现，发芽谷物在氮气中储存可以提高其GABA含量，12小时处理后浓度是处理前四倍，从3.7mg/L增加到14.3mg/L。,1.高效液相法中各衍生试剂优缺点比较,2.测定方法比较,谢谢,
