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1、第六章 生物技术与环境,人类和环境的相互关系,人类和环境的相互关系,环境问题,水土流失,水环境污染,大气污染,土地荒漠化,环境问题是指由于人类活动作用于周围环境所引起的环境质量变化，以及这种变化对人类的生产、生活和健康造成的影响。,环境问题,环境污染给人类健康带来严重的威胁,莫斯科 1993年 格德.鲁德威。1973年以后在莫斯科工业区附近，已经出生了90名四肢不全的畸形儿。 (国家地理杂志),“癌症村地图”未必是一份准确的地图,颇具特色的应用技术,环境生物技术,环 境 污 染 的 监 控 技 术,污 染 物 的 微 生 物 降 解 技 术,污 染 场 地 的 生 物 修 复 技 术,环境 友
2、好 材料 的生 物合 成技 术,固 体 废 物 的 强 化 处 理 技 术,第一节 环境的生物检测技术,生物检测技术(biological detection techniques)：利用某些生物材料（如酶、抗体、组织、细胞等）对一定的化学物质具有的特异性识别能力或灵敏响应能力，研究开发环境中污染物的检测，称作生物检测技术。 这些技术主要有生化检测试剂盒(test kits)、生化检测条(test strips)、生物传感器(biosensors)以及生化方法与传统分析方法的联用等。,一、PCR(polymerase chain reaction)技术,1.PCR技术的原理和方法 （1）PCR
3、技术的原理 PCR技术是一种利用DNA变性与复性原理，在体外进行特定序列DNA片段快速扩增的有效方法。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。 （2）应用PCR技术检测环境微生物的方法,收集细胞,提取DNA,PCR循环,产物分析,图10-1 PCR工作原理图,2.PCR技术在环境监测中的应用,(1)检测环境中的微生物 优点：与传统生物检测方法相比，PCR方法不仅检测时间短、灵敏度高，还可以检测出一些依靠培养法不能检测的微生物种类。 (2)检测环境中的致病菌和指示菌 环境中存在着多种多样的致病微生物，
4、它们与许多传染性疾病的传播和流行密切相关。 (3)跟踪检测环境中的基因工程菌株 基因工程菌(gene engineered microorganisms，GEMs) 出于研究工作本身的需要和安全因素，检测环境中基因工程菌的动态显得十分重要。,二、生物传感器技术,传感器(sensor) 是指那些对被测对象的某一确定的信息具有感受与检出功能，并按照一定规律转换成与之对应的有用信号的元器件或装置。 种类：物理传感器、化学传感器和生物传感器三大类 生物传感器（biosensor）是由生物学、医学、电化学、光学、热学及电子技术等多学科相互渗透而产生的一种分析检测装置。,自己阅读,待测物质进入生物活性材料
5、(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电、声、光等信号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物浓度。其特点是专一性强、分析速度快、操作简便、能进行在线分析甚至活体分析且能检测极微量的污染物，,（1） 生物传感器的检测原理,（2）生物传感器的分类,酶传感器（enzymatic biosensor） 不同酶传感器检测污染物机理是不同的。据报导，有些酶对污染物具有催化转化能力(如酪氨酸酶对酚类)，有些污染物对酶活性有特异性抑制作用，或作为调节、辅助因子对酶活性进行改饰。 微生物传感器 微生物传感器(mi
6、crobial biosensor)是指从活性污泥、河水、腐殖质中分离出来的一些微生物，如细菌、酵母和真菌等制成的传感器。 免疫传感器(immunological biosensor) 免疫传感器利用了抗体和抗原之间的免疫化学反应。 DNA传感器(DNA biosensor) DNA传感器一般由一个固定DNA片段的电极和用于检测的电活性杂交指示剂构成，DNA传感器的理论基础是DNA碱基配对原理。,2.生物传感器技术在环境监测中的应用,（1）生物传感器在水质环境监测的应用 对BOD的监测 生化需氧量（biochemical oxygen demand, BOD）是测试水体中有机污染物的指标，被广
7、泛应用的传统的检测方法一般需要5天时间，因此被称为BOD5法。 对硝酸盐的监测 用于水环境中含量测定的生物传感器主要是通过测定被还原成NO-2时产生的还原电流的大小来反映含量。 对酚类污染物的监测 酚类污染物属于高毒性物质，通过工业排放废水进入水环境，是水环境中一个重要的监测指标。 对其他污染物的监测 如用于磷酸盐监测的生物传感器，重金属、硫化物以及残留农药等污染物监测的生物传感器，阴离子表面活性剂监测的生物传感器等，都有较好的监测效果，同时也在不断的完善之中。,（2）生物传感器在大气环境监测中的应用,常见的污染因子主要有NOX、SO2、总悬浮颗粒物（total suspended parti
8、culates，TSP）、CO2等，其中NOX和SO2对大气环境的危害尤为严重，是酸雨、酸雾形成的主要原因，NOX同时还是光化学污染的主要原因。 对NOX的监测 用于测定NOX的生物传感器由多孔气体渗透膜、固定化硝化细菌和氧电极组合而成。该传感器中硝化细菌以亚硝酸盐作为唯一的能源，其呼吸活性随亚硝酸盐的存在增加，呼吸过程导致的溶解氧浓度降低量可由氧电极检测，从而间接反映出亚硝酸盐的含量以此反映大气中NOX的含量。 对SO2的监测 用于测定SO2的生物传感器由含亚硫酸盐氧化酶的肝微粒体和氧电极制成。该传感器测定雨水中亚硫酸盐的浓度来反映大气中SO2的含量。,三、酶免疫检测技术,酶免疫检测(enz
9、yme immunoassay，EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种免疫分析技术，是标记免疫分析中的一项重要技术，也称之为“酶联免疫吸附剂测定” (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，因为测定中应用了固相吸附剂以便于分离“游离的”和“结合的”酶结合物。 EIA是在放射免疫分析(radio immunoassay，RIA)理论的基础上于20世纪70年代初发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。,（1）EIA的原理 EIA是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以酶作为标记物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特性，
10、然后将酶标记物的抗体作为标准试剂来鉴定未知的抗原。抗体是哺乳动物为了自我保护，而对外界抗原刺激产生的特异性血清蛋白。它由两条长链和两条短链组成Y型对称结构，在Y顶端的两条支链特性是易变的，可通过细胞调节与外来刺激分子的结构相匹配、使其能识别特定的分子。,1.酶免疫分析方法原理及类型,酶免疫测定法的分类,ELISA 是目前环境监测中最常用的方法,间接法测定抗原 将特异性抗原包被在固相载体上，从而形成固相抗原，加入待检样品(含相应抗体)，抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗体(又称二抗)与上述复合物结合，此时加入底物，复合物上的酶则与催化底物反应而显色，由于每步之间均有冲洗步骤，因
11、此，若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应；若样品中含相应的抗体，底物显色则呈阳性反应。,双抗体夹心法测抗原 将已知的特异性抗体包被在固相载体上形成固相抗体，加入待检样品(含相应抗原)，其中抗原与固相抗体结合成复合物，再加入特异性的酶标抗体，使之与已形成的抗原-抗体复合物结合，当加入底物时，酶则催化底物而显色，根据颜色的有无和深浅，对待测抗原进行定性和定量分析。 竞争法测抗原 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，加入待测样品(含相应抗原)和相应的一定量的酶标抗原，样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测样品中抗原含量越高，则与固相抗体结合的越多，使得酶标
12、抗原与固相抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合，这样加入底物后就不显色或显色很浅，显色深者为阴性。,2.EIA方法在环境污染检测中的应用,在环境监测中，单克隆抗体具有更多的优越之处： 可以筛选到亲和力很强的抗体； 单抗试剂稳定，易建立标准方法，可比较出自不同实验室的数据。 EIA技术用于检测水、土壤、食品中的各种农药残留，方法简便、快速、前处理程序简化（不需净化），反应既可在试管中进行，也可在微孔板上进行；若在96孔板上，每次可分析几十个样品，且可同时作出标准曲线。适合于EIA检测的环境化合物必须是亲水性的，不挥发的，在水中稳定性好的，如磺酰基尿素、苯酰基尿素、氨基甲酸酯、除莠剂，基因工程及
13、微生物的蛋白质产物等（见表10-1）,探针（probe）是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。 探针能与被探测物质之间相互发生反应，如抗原-抗体、血凝素-碳水化合物、亲合素-生物素、受体和配体，以及核酸与其互补核酸间的杂交等反应均属此类。基于核酸分子杂交原理的核酸探针(nucleic acid probe)可理解为一类能特异性识别目标分子(核酸序列)，并适合直接检测或带有可检测标记物(放射性或非放射性的)的核苷酸序列。,四、核酸探针检测技术,1.核酸探针检测技术的原理,核酸杂交 (nucleic acid hybridization) 一般把待测的单链靶核酸固定在载
14、体上，置与适当的溶液中，加入已标记好的核酸探针，这时给予合适的退火条件，如果靶核酸和探针核酸的序列具有同源性，它们就会缔合成双链结构即核酸杂交. 把未能与靶核酸杂交的探针核酸通过洗涤去掉，再经过相应措施，使探针结合的部位显示出来，就可以判断靶核酸是否与探针核酸有同源性，同源性的片段的大小，同源性片段所在的位置等。 杂交实验中所用到的核酸探针通常以要检测的序列为基础，它们可以来自DNA、RNA、寡聚核苷酸或cDNA等。,核酸探针检测的技术流程,2.核酸探针的种类与检测方法,（1）核酸探针的标记物 放射性标记 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35
15、S。其中，以32P应用最普遍。 优缺点：放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级；缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、不稳定、成本高。 非放射性标记 目前应用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，二者都是半抗原。,（2）核酸探针的种类及制备方法,DNA探针 DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。 cDNA探针 cDNA（complementary DNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。 RNA探针 RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。 寡核酸探针 根据
16、已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。 探针的制备就是合成含有标记的核苷酸序列。 * RNA探针的制备是先把DNA克隆于载体上，然后在RNA聚合酶的作用下合成含有标记的脱氧核苷三磷酸dNTP的单链RNA探针；cDNA探针的合成是首先提取生物的总RNA，用它作模板，在反转录酶的作用下合成放射性标记的cDNA探针。,（3）核酸探针检测的方法,核酸探针检测技术以核酸分子杂交技术为核心，因此核酸杂交技术种类决定了检测的主要方法。 核酸杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种（如图10-6所示）。 通常，杂交在溶液(液相)中进行得比较快，所需要的探针分子的量也较少。而固相杂交中目标核苷酸序列或探针分子被固定在硝酸纤维素膜或尼龙滤膜上，其最大好处是可以分析各种不同纯度的核酸，从而可以轻易地在同一时间处理和定量多个样品，因此在目前得到广泛应用。 根据碱基互补配对的原则，被标记的核苷酸探针可以原位杂交、Southern印迹杂交、斑点印迹等不同的方法，直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源
