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1、第一节、微生物的生长规律及其测定方法 第二节、微生物培养法概论 第三节、有害微生物的控制,第六章、微生物的生长与控制,因微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。 一、同步生长及其方法 1.同步生长 一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，即分裂步调一致。,第一节、微生物的生长规律及其测定方法,2.获得同步生长的方法,（1）环境条件诱导法 温度：适宜和不适宜交替处理，如芽孢杆菌。 培养基成分控制 营养不足和营养丰富交替培养； 含抗生素和完全培养基交替培养； 光照和黑暗交替：用于光合细菌。,（2）筛选法,二、分批培养细菌的生长规律 1.分批培养和连续培养 （1）分批培养 菌
2、体接种到定量的培养基中（不再补充和更换），培养并收获，实验室常用。 （2）连续培养 培养过程中，不断提供营养，并排出有害产物，使得菌体长时间处于旺盛的生长状态生产菌体和代谢产物，生产中常用。,少量单细胞的纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。 以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线，能反映整个培养期间菌数变化规律。,生长曲线分为:延滞期，对数生长期，稳定期，衰退期。,（1）延滞期-“万事开头难” 为何产生？ 为适应环境进行调整；接种时损伤。 特点 代谢活跃（酶和ATP合成增加），体积变大，数量不增加。 影响因素 菌种,接种
3、物菌龄,接种量,培养基成分差别。 实践指导意义 在发酵工业上尽量缩短（如何缩短呢？） 在食品工业上，在此期消毒或灭菌。,（2）对数期 特点：代谢最旺盛，代时最短，菌数的对数和时间呈线性关系，菌体形态大小、生理特征较一致。 客观影响因素（除菌种代时不同外） 温度 在适温范围内，每增加10，生长速度提高1倍。,营养：成分和浓度（较低浓度下影响生长速率和菌体产量生长限制因子）。 氧气 好氧菌若能供给充足的氧，可能使对数期延长。,指导意义 良好研究（染色、观察、生理代谢等）与诱变材料。 增殖phage或接种的最适菌龄； 工业上，尽量延长该期提高菌体密度。 食品工业上，使有害菌不能进入此期。,（3）稳定
4、期(新生率=死亡率) 特点 数目最多；开始积累内含物（糖原、异染粒等），芽孢以及次生产物开始形成。 产生原因 营养受限（耗尽，C/N失调）； 有害废物的积累（酸、醇、毒素等）pH、氧化还原势等不合适。,应用 生产上，延长该时期提高产量（补料、调pH、提高通气量等）。收获细胞及初级产物的最佳时期（如乳酸、柠檬酸、SCP等，其产生和细胞生长同步）。 生物测定维生素、氨基酸和碱基的最佳时期。,（4）衰亡期 负生长，出现衰退形，释放芽孢和次生产物，细胞死亡、自溶。比其他各时期时间长。 注：稳定期后期或衰亡期收获次生产物最佳时期（其产生和细胞生长不同步）。,孢子接种液体培养基培养（产生孢子否？）。 以时
5、间为横坐标，菌丝干重为纵坐标，绘曲线。 包括：停滞期；迅速生长期；衰亡期。,三、丝状微生物的群体生长规律,菌丝体干重,四、微生物纯培养生长的测定 指群体生长（细胞数目或生长量）的测定。 （一）细胞数目检测 1.直接法（血球计数板、比例计数法） 2.间接法（平板计数法、膜过滤法） （二）微生物生长量测定 1.直接法(干重法，堆体积法) 2.间接法（比浊法，碳、氮含量法）,1.涂片染色法 （1）特点：可同时计数不同微生物个数。 （2）方法 将0.1ml菌液涂于1cm2面积上选若干视野用镜台测微尺计算视野面积计数按公式计算； 菌数（个/ml）=视野中平均菌数(涂布面积/视野面积)10稀释倍数,2.平
6、板菌落计数法,注 按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落数在30-300之间为报告依据。,3.薄膜过滤法 测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。,4.干重法 菌体离心或过滤烘干至恒重(干燥温度可采用105、100或80)称重。 该法适合菌浓度较高的样品。 5.比浊法 用分光光度计，一定波长下，测定菌悬液的OD值，计算菌数。测量应在菌浓度与OD值呈正比的线性范围内，否则不准。,五、连续培养,单批培养到对数期后期时，以一定的速度流进新鲜培养基，同时以溢流方式流出培养液培养物长时间处于对数生长期或稳定的生长速率； 理论基础：分批培养生长曲线中，有稳定期，采取措施推迟稳定期的到来。
7、,1.连续培养器 （1）恒化器 恒速流进培养基，营养浓度恒定，生长速率恒定。 原理：某一种营养物为亚适量（如碳、氮源、生长因子等）生长限制因子菌始终低于最高生长速率。 特点：生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究。,（2）恒浊器-培养液混浊度恒定,设定培养物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低； 当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,恒浊器与恒化器的比较,2.单级和多级连续培养 单级：代谢产物和菌体相平行时使用； 多级：与上相反，
8、如丙酮、丁醇。 丙酮丁醇梭菌：菌体生长期（37，产菌为主）；产物合成期（33，产丙酮、丁醇为主）。 两级培养：第一级罐37，pH4.3，稀释率0.125/h；第二级为33，pH4.3，稀释率0.04/h。,3.连续培养的优点和缺点 （1）优点 简化操作，自控，产品稳定，节约成本。 （2）缺点 菌种易衰退，培养物易污染，营养物利用率低，一般只能维持数月-1年。,第二节 微生物培养法,一、实验室培养法 （一）固体培养 1.好氧菌：试管斜面、平板等。 2.厌氧菌 （1）高层琼脂柱：加还原剂,石蜡封口。 （2）Hungate滚管,厌氧菌计数：铜柱除氧预还原培养基、稀释液制备稀释样品滚管培养计数。 预还
9、原培养基和稀释液制备 煮沸驱氧分装到螺口厌氧滚管（4.5-5ml培养基或稀释液9ml）通N2排除O2。 含指示剂刃天青，由蓝红无色（无氧状态）盖丁烯胶塞及螺盖灭菌。,滚管 培养基融化并冷却（45-50）加稀释样品0.1ml平放滚管机上滚动（内有冰）培养24-48h后计数。,（3）厌氧培养皿 （4）厌氧罐技术 含钯催化剂和美蓝； 3次抽真空，2次灌氮，最后灌N2+CO2+H2，催化H2+O2,美蓝被还原成无色。,（5）厌氧手套箱,(二) 液体培养 1.好氧菌的培养 （1）试管、浅层培养：仅适合兼性厌氧菌。 （2）摇瓶培养和台式发酵罐,2.厌氧菌的培养 须加还原剂(如巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C、
10、铁粉等) ，封凡士林-石蜡层隔氧。 所需容器：磨口三角瓶、带螺旋口的试管等。,二、生产中的微生物培养 (一)固体培养 1.好氧菌曲法培养 2.厌氧堆积培养：深层地窖，如白酒（大曲，小曲，麸曲）。,3.常见的几种曲 大曲（块曲或砖曲）以大麦、小麦、豌豆等为原料，粉碎，加水，压成砖块状曲醅，让自然界微生物生长而成用于蒸馏酒的酿造； 小曲大米粉+米糠+少量中药（促生长），人为接种，经自然发酵而成用于米香型酒（如黄酒）的酿造。 麸曲麸皮为原料，接霉菌后的培养物，可代替部分大曲或小曲，是我国白酒生产的主要方法。,挂曲,小 曲,红 曲,(二)液体培养 1.好氧菌的培养 早期浅盘培养，现代是发酵罐深层培养。
11、 2.厌氧菌大规模的液体培养装置（较少） 丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇发酵。,（三）、固定化酶和固定化细胞 1.固定化酶 水溶性酶+载体(疏水相互作用，范德华力，H键，离子键或直接包埋)不溶于水、有酶活性不易流失、可多次使用。 2.固定化酶的优点 可重复使用，产品分离、提纯等较容易； 可制成高密度，抗酸、碱、温度变化、活力稳定的酶。 3.固定化细胞可以是死的，也可以是活的。,（四）、混合发酵 1.能充分利用培养基、设备，提高产品质量。 产黄纤维单孢菌+恶臭假单孢菌利用纸浆纤维生产5单核酸和单细胞蛋白； pH6，产黄纤维单孢菌停止生长，恶臭假单孢菌能利用前者产生的可溶糖，把pH维持在6.5-7.0之间
12、。 2.混合发酵能带来一些独特的产品,如茅台酒。,3.组合不同菌，可替代某些重组菌。 华根霉产延胡索酸（酸味剂，与苯乙烯共聚产玻璃钢）； 华根霉+E.coli产琥珀酸（洗涤剂中的起泡剂，食品酸味剂）； 华根霉+毕赤酵母产L-苹果酸（食品酸味剂，提高兴奋）。,三、培养过程中pH的变化及调节 1.pH变化 （1）偏酸 有机物（糖、脂肪）水解后有机酸 （NH4）2SO4，NH4+选择性吸收H2SO4； （2）偏碱 有机物（蛋白质）脱羧胺类 NaNO3，NO3-选择性吸收NaOH。,2.pH调节 （1）治标：酸碱调节； （2）治本： 偏酸时：加氮源（尿素，NaNO3等），提高通气量； 偏碱时：加碳源（
13、糖、乳酸、醋酸等），降低通气量。,第三节、有害微生物的控制,一、基本概念 二、高温杀菌 三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,一、基本概念 1.灭菌 永远丧失生长繁殖能力（包括芽孢），有杀菌和溶菌。 2.防腐：即抑菌 （1）添加防腐剂：如苯甲酸/苯甲酸钠（不允许在乳制品中添加）、山梨酸/山梨酸钾（公认安全）； （2）低温（4以下）； （3）缺氧（加铁粉）、干燥（CaCl2，P2O5）； （4）高渗(腌菜)，高醇（醉蟹）。,3.消毒 条件温和，只杀死表面或内部部分有害菌（营养细胞）,如巴氏消毒。 4.化疗 用高选择性化学物质抑制病菌和肿瘤细胞生长繁殖。 如阿霉素(嵌入DNA，改变空间结构，抑制核酸复制
14、，主治急性白血病) 、表阿霉素、柔红霉素（DNA插入剂，空间结构改变）、丝裂霉素（交联DNA，影响复制）等。,二、高温杀菌,注：湿热灭菌效果比干热效果好,1.烘箱热空气灭菌法 条件：150170，12小时； 注意事项？ 2.灼烧 3.巴氏消毒法 杀无芽孢病原菌(如结核杆菌或沙门氏菌) （1）低温维持法：63，30min （2）高温瞬时法：72，15s 注：超高温灭菌：135-150，2-6s（灭菌奶）。,4.煮沸消毒法：100，数分钟。 5.间歇灭菌法 适于不耐热培养基灭菌。 6.常规加压灭菌法 (应用最为广泛) （1）条件：121，1520min；115，35min。 （2）注意事项？ 7.
15、连续加压灭菌法（连消法） 135140，515秒，在工厂中培养基灭菌用。,三、化学杀菌剂或制菌剂,（一）表面消毒剂(非选择性) 对一切活细胞都有毒性，如0.1-0.5%CuSO4(与蛋白质巯基结合致变性)，苯酚（氧化破坏Pr），甲醛（破坏Pr氢键或氨基），龙胆紫（结合Pr羧基，致癌）。 石炭酸系数(p.c.) 表示表面消毒剂的相对杀菌强度。 指在一定时间(10min)内，被试药剂杀死全部供试菌(伤寒沙门氏菌)的最高稀释度与同效的石炭酸的最高稀释度的比值。,（二）抗代谢药物（选择性）,细胞内必要代谢物结构类似物，有很好的选择毒力，如磺胺、异烟肼、氨基叶酸等。 1.磺胺（磺胺胍，磺胺嘧啶等） 19
16、34年发明，青霉素使用前抗细菌感染的王牌药，抗菌谱较广，对G+（如肺炎球菌 ），G-（脑膜炎球菌）和放线菌都有作用。 （1）磺胺类药物和TMP（三甲基苄二氨嘧啶）抑菌机制,（2）思考 人体正常细胞为什么不会收到该药物的影响？ （3）磺胺类药物作用的缺点？ 受PABA和二氢叶酸浓度的限制！ 使用不当，易产生抗性（缺二氢蝶酸合成酶或可合成大量PABA）。,2.异烟肼（吡哆醇的结构类似物，特异性对结核杆菌） 1912年合成，1952年发现其杀菌作用，主治肺结核（还有链霉素和对氨基水杨酸）。 （1）杀菌机理 抑制结核菌特有的分枝菌酸酶干扰分枝菌酸的合成菌丧失多种能力（抗酸性，增殖力，疏水性）而死亡； 与菌体辅酶结合干扰核酸合成杀菌； 在cell中被氧化成异烟酸（与烟酰酶相似），其取代烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD)中的烟酰胺，形成NAD的同系物，干扰NAD
