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1、第六章 微生物的遗传和变异,主要内容,微生物的遗传 微生物的变异 基因重组 突变体的检测与筛选 分子遗传学技术在环境工程和环境保护中的应用,一. 遗传与变异的物质基础DNA,第一节 微生物的遗传,证据1： 1928年格里菲斯肺炎链球菌转化实验 1941年艾弗里肺炎链球菌转化补充实验,证据2： 1952年赫西和蔡斯大肠杆菌T2噬菌体感染大肠杆菌实验,基本组成元素：C、H、O、N、P,基本单位：脱氧核苷酸,（一）DNA的结构,二、DNA的结构与复制,DNA的分子组成:,DNA的平面结构：脱氧核苷酸长链,DNA的空间结构: 双螺旋结构,1、DNA的存在形式,真核微生物,原核微生物,DNA+组蛋白染色
2、体+核膜真核,DNA +少量蛋白环状染色体拟核,2、基因遗传因子,基因是具有固定的起点和终点的核苷酸或密码的线性序列。是编码多肽、tRNA或rRNA的多核苷酸序列。 基因按功能可分为三种 结构基因编码蛋白质或酶的结构 操纵区“开关”，操纵结构基因的表达 调节基因编码调节蛋白，与操纵区结合，控制结构基因表达,大肠杆菌乳糖操纵子的结构及调节,R,P,O,结构基因3个,Z、Y、A：结构基因 P：启动子 O：操纵基因 R：调节基因,Z Y A,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷酶 透过酶,-半乳糖苷酶 乙酰氨基转移酶,R,P,O,Z Y A,阻遏蛋白,阻抑蛋白封闭操纵区，结构基因不表达,R,P,O,Z Y A,
3、阻遏蛋白,诱导物与阻抑蛋白结合，阻抑蛋白不能封闭操纵区，结构基因得以表达,诱导物,3、遗传信息的传递中心法则,（二）DNA的复制半保留复制,三、DNA的变性和复性,（一）DNA的变性 概念当天然双链DNA受热或其他因素的作用下，两条链之间的结合力被破坏而分开成单链DNA，即称为DNA变性。 导致DNA变性的因素 加热80 100，完全解链 提高pH pH11.3，完全变性 变性试剂尿素和甲硫胺,（G+C）%=（Tm-69.3）2.44,（二）DNA的复性（退火） 概念变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 复性的DNA是随机结合的，只能部分保
4、持原有性状。,四、RNA,1、RNA和DNA组成的区别 核糖代替脱氧核糖 尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T）,2、RNA的种类 mRNA（信使RNA） tRNA（转运RNA） rRNA（核糖体RNA） 反义RNA（调节DNA复制、转录和翻译）,五、微生物的生长,1. 微生物的生长主要是蛋白质的合成 平衡生长：当微生物的生长进入对数期，细胞中全部的生化组成都以相同的速率进行合成，这个过程称为平衡生长。,2. 蛋白质合成过程,DNA复制 DNA转录 tRNA翻译 蛋白质合成,原核微生物的转录过程,转录的酶RNA聚合酶,RNA聚合酶组成：2+ 亚基解开前方DNA双螺旋、恢复后面的DNA双螺旋； 亚基催化
5、磷酸二酯键的形成； 亚基与DNA非模板链结合； 亚基识别DNA转录的起始部位，从而引导全酶结合上去。 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。,核心酶,全酶,转录起始,转录延长阶段亚基脱落,起始：RNA聚合酶与DNA模板的启动子(promoter)结合,-35,-10,Pribnow box(普里布诺盒),转录过程,延长：在RNA聚合酶催化下，以模板链为模板按5 3方向合成互补的RNA链。,终止：RNA聚合酶到达转录终止区，则停止转录。 终止子能够使RNA转录停止的DNA序列。,终止的方式： （1）依赖于（Rho）因子的终止 （2）不依赖于 （Rho）因子的终止,（1）依赖于因子的终止,（2）不依赖于
6、因子的终止,茎环/发夹结构,细菌mRNA多数不用加工，转录与翻译是偶联的。 少数多顺反子信使RNA（一种能作为两种或多种多肽链翻译模板的信使RNA ）必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。如核糖体大亚基蛋白与RNA聚合酶的亚基基因组成混合操纵子，转录后需经RNA酶III切开，各自翻译。因为RNA聚合酶的合成水平低得多，切开有利于各自的翻译调控。,转录后加工,真核微生物的转录过程,转录的酶3种RNA聚合酶,转录过程,起始,RNA聚合酶接合在起始位点附近，由转录因子（TF）协助识别启动子。 目前已知RNA聚合酶至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（trans-c
7、riptional factor, TF)。包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I。,延长,终止,真核生物转录终止的机制，目前了解尚不多，而且3种RNA聚合酶的转录终止不完全相同。 RNA聚合酶催化的转录有18 bp的终止子序列，可被辅助因子识别。 RNA聚合酶II和III催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖因子的终止子相似的结构和终止机制，即有富含GC的茎-环结构(stem-loop structure)和连续的U。 由于成熟的mRNA 3端已被切除了一段并加入了poly A尾，具体的转录终止点目前尚未认识。,转录后加工 加帽：转录合成前体RNA（hn RNA ）在磷酸酶
8、的作用下，将5-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化;,加尾：这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。,剪接：核内小RNA（snRNA）与蛋白质结合形成小核核糖核蛋白颗粒（ snRNP ），可识别内含子和外显子的交接位点，从而将内含子切割下来，并准确地将各外显子拼接好，成为完好的具有功能的mRNA。,外显子,原核微生物和真核微生物转录过程的区别,真核微生物RNA的转录是在细胞核内进行的，而蛋白质的合成则是在细胞质内进行的。所以，RNA转录后首先必须从核内运输到细胞质内，才能指导蛋白质的合成。 真核微生物
9、一个mRNA分子一般只含有一个基因，编码一条多肽链； 原核微生物的一个mRNA分子通常含有多个基因。,在原核微生物中只有一种RNA聚合酶，催化所有RNA的合成；而在真核微生物中则有RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶三种不同酶，分别催化不同种类型RNA的合成。 原核生物中RNA聚合酶可以直接起始转录合成RNA ，真核生物则不能独立转录RNA 。 在真核生物中，三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录。另外，RNA聚合酶对转录启动子的识别，也比原核生物更加复杂。,六、微生物的细胞分裂,DNA复制 蛋白质合成,第二节 微生物的变异,一、变异的实质基因突变 生物DNA碱
10、基系列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变。,二、基因突变的类型 （一）自发突变：指某种生物在自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。 （二）诱发突变：是指利用物理或化学因素处理生物群体，促使少数个体细胞的DNA分子结构发生突变，在基因内部碱基配对发生差别，引起生物的遗传性状发生突变。 物理诱变 化学诱变 复合处理及协同效应 定向培育和驯化,定向培育（驯化）,人为用某一种特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体。 环境工程中常用这种方法培育新菌种。,第三节 基因重组,基因重组：两个不同性状的个体
11、细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异，产生新品种的过程。 基因重组包括杂交、转化和转导等方法。,一、杂交（hybridization ）,细菌有性生殖,通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组，或是通过双亲细胞的部分沟通，使部分染色体基因重组的现象。,二、转化（Transformation）,受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组里，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象。,受体细菌获得了供体细菌的部分遗传性状“转运同化” 目前发现自然状态下许多其它细菌、放线菌、真菌和高等动植物中都也有转化现象。,通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因（DNA片段
12、）携带至受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,三、转导（Transduction）,转导是1952年ND津德和J莱德伯格在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。,LA-2,A,-,B,+,LA-22,A,+,B,-,LA-2,是,能,合,成色氨酸,（,B,+,）但,不,能,合成组氨,酸,（,A,-,）的,沙门氏伤寒,杆菌,超微烧结玻璃板,细菌不能通过，,噬菌体可以通过,转导,能合成色氨酸,间谍,侵入、重组,“转移、导手”,第四节 突变体的检测与筛选,一、突变体的检测 1、直接检测表现型 2、间接检测法通过控制培养条件获得突变体（如Ames实验）。,二、突变体的筛选 筛选方法：创造一种只允
13、许突变体生长，抑制原养型菌生长的培养基或生长环境条件。,第五节 分子遗传学技术在环境工程和环境保护中的应用,一、遗传工程在环境保护中的应用 遗传工程是70年代初发展起来的生物技术。 定义：对遗传物质进行改造（人工干预下的杂交、转化、接合、转导）的技术。 特点：类似工程设计那样有很高的预见性、精确性与严密性。 应用：质粒育种,（一）质粒育种简介,1、质粒：原核微生物中，游离于核基因组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子。 2、质粒的类型 接合性质粒 抗药性质粒 产细菌素和抗生素质粒 具生理功能的质粒（如降解质粒） 产毒质粒,3、质粒育种,将两种或多种微生物通过细胞结合或融合技术，使供
14、体菌的质粒转移到受体菌内，使受体菌保留自身功能质粒，同时获得供体菌的功能质粒，即培育具有两种或多种功能质料的新品种的过程。,（二）质粒育种技术在环境保护中的应用,（1）多功能超级细菌的构建 降解芳烃、萜烃、多环芳烃和脂烃 （2）解烷抗汞质粒菌的构建 降解辛烷、乙烷、癸烷和耐高浓度汞 （3）脱色工程菌的构建 分解两种偶氮染料 （4）Q5T工程菌的构建 在低温下降解甲苯和二甲苯,二、基因工程技术,1、基因工程（gene engineering）的概念 是根据人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载
15、体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。,从供体细胞选择获取含目的基因的DNA片段 将目的DNA片段和质粒在体外重组 将重组体转入受体细胞 重组体克隆的筛选与鉴定 外源基因表达产物的分离与提纯,2、基因工程的操作步骤,3、基因工程在环境保护中的应用,超级细菌的构建 在原核微生物与动物之间、动物与植物之间的转基因工程，有利于环境保护。,1、PCR技术简介 PCRDNA多聚酶链式反应技术。 PCR的原理：利用适宜的引物、DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸（dNTP）以及合适的反应条件使靶DNA的拷贝数在短时间内（几小时）在体外增加百万倍以上，从而容易对靶DNA序列进行分析。,三、PCR技术,加热变性将双链DNA加热（9495）变性为两条单链DNA，作为扩增模板； 退火单链DNA溶液温度下降至55，引物DNA碱基与单链模板DNA碱基互补配对； 延伸72 温度下，由合成酶（ DNA 高温多聚酶）催化，从引物开始合成目的基因； 电泳将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察,2、PCR的操作步骤,P C R 操作流程,95 0 C,55 0 C,72 0 C,DNA互补双链,复制起点,DNA合成,研究特定环境中微生物区系的组成、结构
