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1、微生物的遗传变异和育种,第八章,本章主要内容,第一节 遗传变异的物质基础 第二节 基因突变和诱变育种 第三节 基因重组和杂交育种 第四节 菌种的衰退、复壮和保藏,第一节 遗传变异的物质基础,遗传：亲代传递给子代一套相同性状的遗传信息。特点：具稳定性。 变异:生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。,什么是遗传物质？,19世纪末，德国学者 A. Weismann 生物体分体质和种质两部分。种质（遗传物质）具有稳定性和连续性，且为特定分子结构的化合物。 T. H. Morgan 20世纪初，提出基因学说，遗传物质为染色体。 1944年，Avery 等以微生物为研究对象证实了,遗传
2、物质是蛋白质 or 核酸,？,核酸是遗传的物质基础,一、证明核酸是遗传物质的三个经典实验,1、肺炎链球菌的转化实验 2、噬菌体感染实验 3、植物病毒的重建实验,1、肺炎链球菌的转化试验,1928年，英国细菌学家 F. Griffith 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌） S型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性 R型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,小鼠致死的原因为IIIS菌株的毒性，但是IIIS从何而来呢？ 注入到体内的IIIS菌全部被杀死，不可能是其残留； 不是IIR的回复突变，因其回复突变型应为IIS; 合理解释为：活的非致病性的IIR从已被杀死
3、的IIIS型中获 得了遗传物质，使其产生荚膜成为致病性的IIIS 。,Avery： 热死的IIIS型菌株中何种细胞成分为转化因子,DNA 蛋白质 荚膜多糖,DNA 被降解或破坏的抽提物无转化作用； IIIS型的DNA能够将IIR型菌株转化为IIIS型； DNA是Griffith转化实验中的转化因子。,2、噬菌体的感染试验,1952年，A. D. Hershey 和 M. Chase 证实DNA是噬菌体的遗传物质 实验： 将大肠杆菌在以放射性32P和35S标记的磷源和硫源的组合培养基中培养，制备出含有32P-DNA 核心的噬菌体或含有35S标记的蛋白质外壳的噬菌体。 将得到的两种噬菌体分别感染大
4、肠杆菌。,沉淀细胞培养后产生大量完整的子代噬菌体。,在噬菌体感染过程中，蛋白质外壳根本未进入宿主细胞； 进入细胞的只有DNA，却可产生完整的子代噬菌体； 在其DNA中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息； 由此证明DNA是噬菌体的遗传物质。,3、植物病毒的拆开与重建试验,在RNA病毒中，遗传的物质基础是核酸RNA。,只有核酸才是负载遗传信 息的真正物质基础。,1、肺炎链球菌的转化试验 2、噬菌体的感染试验 3、植物病毒的拆开与重建实验,二、微生物的遗传物质,核基因组： 定义：真核生物的细胞核或原核生物细胞的核区，为该微生物遗传信息的最主要负荷者，称为核基因组。 真核微生物细胞核具有核膜包
5、裹、形态固定的真核，核内的DNA与组蛋白结合在一起形成在光学显微镜下能见的核染色体。 原核微生物DNA呈环状双链结构，在细胞中紧密缠绕成较致密的不规则小体，称为拟核。,核外基因 多数在细胞质中还存在DNA含量少，能自主复制的 核外基因。,真核生物的核外染色体,2m质粒特点 封闭环状的双链DNA分子，周长约2m，以高拷贝数存在于细胞中。 只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因，不赋予宿主任何遗传表型。 在细胞内有2种异构体。 线粒体 线粒体基因组是双链环状分子 只编码少数几种最基本的线粒体成分 大多数线粒体蛋白仍由细胞核编码,原核生物的质粒,质粒：游离于原核生物核基因组外，具有独立复制能力的小型
6、共价闭合环状 ds DNA分子。 大小一般为1.5300 kb，相当于1%核基因组。 携带某些核基因组上缺少的基因，使细菌等原核生物获得了某些对其生存并非必不可少的特殊功能，如产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解环境毒物等。 如：F质粒（致育因子，大肠杆菌等细菌决定性别并具有转移能力的质粒）R质粒（含多种抗生素的抗性基因）,原核生物和真核生物基因组的比较,第二节 基因突变和诱变育种,基因突变,基因突变： 泛指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的 可遗传的变化，可自发或诱导产生。,（二）基因突变自发性和不对应性的实验证明（自学） （三）基因突变的机制,诱发突变,点突变：仅一对碱基突变,染色体畸变
7、：一段染色体畸变,自发突变（多因素低剂量，碱基错配）,移码突变：核苷酸增加或缺失,（四）突变的类型： 营养缺陷型某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成 一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在 基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。 抗性突变型野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某 化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。 条件致死突变型某菌株或病毒经基因突变后，在某种条 件下可正常地、生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一 种条件下却无法生长、繁殖。 产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明 显有别于原始菌株的突变株。,诱变育种,1、定义： 诱变育种： 利用物理或化学的诱变剂
8、使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,2、诱变育种的基本过程,选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,（1）、出发菌株的选择,出发菌株用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源： 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,（2）、制备单细胞或单孢子悬液,要
9、求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞 方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。,（3）、诱变处理,诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂 的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂 用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。 致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。 最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死 率在7080%）,诱变育种的基本过程,选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱
10、变处理 筛选 保藏和扩大试验,以选育高产突变株为例，基本环节概括如下：,（4）筛选,分为初筛和复筛两步进行 初筛：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网； 初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛：确认符合要求的菌株； 复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,诱变是随机的，筛选是定向的，后者尤为重要。,（1）产量突变株的筛选,琼脂块培养法 例：筛选春日霉素,突变类型： 产量突变型通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明 显有别于原始菌株的突变株。,创造新型筛选方法简介,（2）抗药性突变株的筛选,梯度平板
11、法定向筛选抗药性突变株 制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板 在其上涂布诱变处理后的细胞悬液 培养后从其上选取抗药性菌落。 例：定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株,突变类型： 抗性突变型野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某 化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。,(3)营养缺陷型突变株的筛选,与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 基本培养基：仅能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基：在基本培养基中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,营养缺陷型 野生型菌株经诱变剂处理后，由
12、于发生了丧失某种酶合 成能力的突变，而只能在该酶合成产物的培养基中才能 生长，这种突变菌株成为营养缺陷型突变株，简称营养 缺陷型。,筛选方法,诱变剂处理,淘汰野生型 利用基本培养基,检出缺陷型,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平板法,青霉素法适用于细菌，青霉素抑制细胞壁的生物合成， 可杀死能正常繁殖的野生型细菌，无法杀死处于休止 状态的营养缺陷型细菌，从而达到浓缩的目的。 制霉菌素法适用于真菌，其为大环内酯类抗生素，与 真菌细胞膜上的甾醇作用，引起膜的损伤，因此只能 杀死生长繁殖的酵母菌或霉菌，故可用于淘汰相应的 野生型菌株和浓缩营养缺陷型菌株。,菌丝过滤法适用于丝状生长的真菌和放
13、线菌。在基本培养基上， 野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。 诱变剂处理后的大量孢子在基本培养基上培养一段时间后，用 滤孔较大的擦镜纸过滤，重复数次，就可除去大部分野生型菌 株，达到浓缩营养缺陷型的目的。,夹层培养法,逐个检出法,影印平板法,限量补充培养法,诱变处理后的细胞,接种到含有微量蛋白胨的基本培养基平板,野生型细胞迅速长成较大菌落，营养缺陷型受限制 生长缓慢，只形成微小菌落。,营养缺陷型的鉴定,生长谱法：供试菌平板点加微量营养物，视某营养物周围是否长菌确定供试菌的营养要求。,生长在完全培养液中的营养缺陷型菌株细胞悬液,菌悬液与基本培养基混合制平板,平板上划分区，添加
14、微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末,某一营养物周围有生长圈，说明该菌就是该营养物的缺陷型突变株,第三节 基因重组和杂交育种,基因重组：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组或遗传重组。 核酸水平上的杂交，可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 杂交育种：指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯合品种的方法。 杂交可以使双亲的基因重新组合，形成各种不同的类型。,一、原核生物的基因重组,转移机制独特而多样： 包括接合、转化和转导、原生质体融合等。,1、接合,定义：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把
15、F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者获得若干新遗传性状的现象，通过接合而获得新遗传性状的受体细胞称为接合子。 主要在细菌和放线菌中存在。 典型 E.coli 的接合作用,E. coli 的4种接合型菌株,根据F质粒在细胞内的存在方式，可把E. coli 分成4种不同接合型菌株： F+菌株 雄性菌株，细胞内存在一至几个F质粒，细胞表面着生一至几条性菌毛。 F-菌株 雌性菌株，细胞中无F质粒、细胞表面无性菌毛的菌株。 Hfr菌株 F质粒从游离态转变成在核染色体组特定位点上的整合态。 F菌株 当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新 形成游离的、但携带整合位点邻近
16、的一小段染色体基因的特殊F质粒， 称F质粒，凡携带F质粒的菌株为F菌株。,（1）F+F-,结果供体细胞和受体细胞均为F+细胞,（2）HfrF-,进入F-的单链DNA 片段经双链化后 形成部分合子，F- 成了部分双倍体。 外源双链DNA片段 与其同源区配对， 经双交换，产生 稳定的接合子。,通过性菌毛接触 形成接合管,Hfr染色体在i部位 断裂并开始复制， 在外界干扰的情 况下，发生接合 中断。,F因子的先导区(leading region)结合着核DNA向受体细胞转移,F因子除先导 区以外,其余绝大部分是处于转移核基因的末端,由于转移过程常被中断,因此F 因子不易转入受体细胞中,故 HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,Hfr 菌株，F质粒由游离态转变成核基因组特定位点上的整合态。,F菌株，Hfr菌株细胞内的F质
