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1、第四章 微生物的营养 第一节 微生物的营养要求 第二节 培养基 第三节 菌种分离及保藏技术,第一节 微生物的营养要求,一、碳源 除水分外，需求最大 (占干细胞重50% )。 1.包括：有机碳和无机碳。 2.功能：提供C和能量。 3.优先利用：如葡萄糖效应（葡萄糖、乳糖）。,二、氮源 1.功能：提供N和部分能量。 2.种类：无机和有机氮。 3.优先利用：（NH4）2SO4被认为速效氮源。 如龟列链霉菌（产土霉素），利用玉米浆黄豆饼粉和花生饼粉。 利用混合氮源，控制菌体生长和产代谢物提高土霉素产量。,三、无机盐 大量元素(10-4-10-3moL/L)：P、S、K、Mg、Fe、Na等； 微量元素(
2、10-8-10-6moL/L）：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等，须控制量。 功能：酶的激活剂（Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cu2+），维持大分子和细胞结构(Ca,Mg,Fe等)，调节渗透压（Na+）和无氧呼吸氢受体(NO3-,SO42-)等。,四、生长因子（酶的辅酶或辅基） 1.种类 维生素（传统生长因子），嘌呤、卟啉、甾醇、脂肪酸等。 2.微生物对生长因子的利用 （1）能合成全部：占大多数（自养型），过量合成型（链霉菌VB12）。 （2）不能或只能部分合成（异养型） 须额外添加对应因子； 如乳酸菌：添加嘌呤核苷酸； 支原体：添加甾醇。,注： 菌不同需生长因子的种类和数量不同; 同种菌，环境
3、不同需生长因子不同。 如鲁氏毛霉：在厌氧需VB1+生物素；好氧自身合成。,五、水 1.分为自由水和结合水。 2.水活度(aw) 微生物可实际利用的环境中自由水的量，或生长环境中水的有效性。 一定温度和压力下，溶液蒸汽压与同条件下纯水蒸汽压的比值。,几类微生物生长最适w,aw=P/P0 P为溶液蒸汽压； P0 为纯水蒸汽压 M的aw一般在0.60-0.99之间,六、能量,化学物质（化能营养型）,有机物：化能异养型,无机物：化能自养型,辐射能（光能营养型）：光能自养和光能异养,七、微生物的营养类型 按碳源、能源、氢供体划分。,注： 区分是相对的。 异养菌：有机物存在可同化CO2 。 自养菌也能利用
4、有机物。 条件变化营养类型改变，如紫色非硫细菌 无有机物：自养 ； 有机物存在：为异养； 厌氧光照：光能营养； 好氧黑暗：化能营养。,第二节 培 养 基,人工配制，适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物所用的营养基质。 一、配制培养基的原则 二、培养基的类型及应用,一 配制培养基的原则,目的明确 营养协调 条件适宜 经济节约,1.目的明确：目的菌、营养类型、什么用。 2.营养协调 浓度合适，比例协调（如C/N）。 如水C源N源无机盐生长因子。 菌不同，C/N不同，细菌、酵母菌为5/1，霉菌为10/1。 同一种菌，生长阶段不同，C/N也不同。如谷氨酸棒杆菌，菌体生长C/N为4/1；谷氨酸积累为3/
5、1。,3.条件适宜 渗透压，pH，氧化还原电位和水活度。 （1）pH 细菌：pH7.0-8.0； 放线菌：pH7.58.5； 酵母和霉菌：pH4.56.0。,调pH方法,外源调节：1mol/L的NaOH和HCl溶液,内 源 调 节,磷酸缓冲剂（KH2PO4和K2HPO4）：产生少量酸、碱时（pH6.4-7.2内起调节作用）。,碳酸钙：中和培养过程中产生大量酸。,培养基中天然缓冲物质：氨基酸，蛋白质。,（2）氧化-还原电位（） 量度还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势。 不同微生物要求值不同。 好氧：0.3-0.4V提高通气量或加氧化剂； 厌氧：+0.1V以下加还原剂（抗坏血酸、Na2S等）； 兼
6、性厌氧：+0.1V有氧呼吸，-0.1V发酵。,4.经济节约 糖蜜（含蔗糖，制糖工业废液） 乳清（含乳糖，乳制品工业废液） 麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉等。 5.附-灭菌处理 121.3，15-20min或115，35min 。 不耐高温物质：先过滤除菌或间歇灭菌混合。 长时间高温磷酸盐、碳酸盐+某些阳离子沉淀。加EDTA，或分开灭菌混合。,6.常见的四种培养基 培养细菌：牛肉膏蛋白胨培养基，pH7.0-7.2 培养放线菌：高氏一号培养基，pH7.2-7.4 培养酵母菌：麦芽汁培养基，自然 培养霉菌：查氏培养基，PDA培养基，pH自然,二、培养基的类型及应用,（一）按成分来源划分 （二）根据物理
7、状态划分 （三）按用途划分,（一）按成分来源划分 1.天然培养基 优点：配制方便、营养多、经济。 缺点：成分杂，不稳定，重复性差。 例：肉汤、麦芽汁培养基。 用途：研究和生产。,2.合成培养基 用途：研究。 优点：重复性强。 缺点：贵、烦琐、生长慢。 例：高氏一号、察氏、葡萄糖铵盐培养基等。 3.半合成培养基 用途：广泛。 例：马铃薯-葡萄糖培养基。,（二）根据物理状态划分 1.固体培养基 （1）固化培养基 液体培养基+琼脂（1.5-2%）或明胶（5-12%）。 用途：分离、鉴定、活菌计数及保藏。 （2）天然固体培养基 （3）非可逆性凝固培养基 血清凝固或用无机硅胶做凝固剂，不能再融化，培养致
8、病菌。 注：凝固剂有琼脂，明胶，硅胶。,2.半固体培养基 液体培养基+琼脂（0.2-0.7%），如明胶培养基。 用途：观察细菌运动、噬菌体效价、厌氧菌的培养和保藏。 3.液体培养基 4.脱水培养基 除水分以外，其他已配制好，如虎红培养基（孟加拉红+氯霉素）。,（三）按用途划分 1.基础培养基 含所需基本营养物质。 2.加富培养基 基础培养基+特殊营养物质(酵母膏,组织液,血液，血清等)。 用途：培养苛刻菌，分离富集菌。 3.鉴别培养基 基础培养基+指示剂（与微生物代谢产物发生显色反应）鉴别菌。,纤维素水解圈,放线菌,霉菌,4.选择培养基 （1）根据特殊营养要求或理化抗性设计分离菌种。 （2）分
9、类 加特殊营养物：如纤维素、蛋白质（氮源）或不加氮源（只加甘露醇）； 加抑制剂 青霉素+链霉素（抑制细菌和放线菌，分离真菌）； 孟加拉红+链霉素+金霉素（分离真菌）； 结晶紫（杀G+，分离G-）； 苯酚或重铬酸钾（抑制细菌和真菌生长，低浓度对放线菌无影响）； 制霉菌素（抑制霉菌和皮肤癣菌，分离细菌和放线菌）。,5.其他 分析培养基：分析化学物质（如抗生素、维生素）的浓度，或微生物的营养要求。 还原性培养基：培养厌氧菌。 组织培养物培养基：含宿主细胞，培养病毒、衣原体、立克次氏体和某些螺旋体等。,第三节 菌种分离及保藏技术 一、纯培养分离技术 固体分离技术、液体培养分离、单细胞分离及其选择培养基
10、分离技术四种。 注：四种技术相辅相成，互相联系。,（一）、利用固体培养基分离纯培养 1.稀释倒平皿法和涂布平板法(10X稀释法，取菌悬液+培养基) 2.平板划线分离法 (连续划线,目的是使cell分散) 3.稀释摇管法,涂布平板法,稀释倒平皿法,1.稀释倒平皿法和涂布平板法,注： 无菌条件下操作； 稀释倒平皿法：温度45-50，长在培养基表面和内部。 涂布平板法：长在培养基表面。,2.平板划线法,3.稀释摇管法 分离厌氧菌，稀释倒平板法的变通形式。 过程 含培养基的试管（50左右）； 梯度稀释样品，摇匀冷凝。 倒灭菌液体石蜡-固体石蜡混合物，培养。 挑单菌落。,（二）、液体培养基分离法 挑较大
11、细菌、原生动物和藻类。 用液体培养基梯度稀释培养。 同一稀释度，若大多数试管没有菌生长（95%）有菌生长的试管纯培养物。,（三）、单细胞分离法 显微镜下直接挑取。 难度与个体的大小成反比，藻类、原生动物易分离，细菌难分离。 （四）、选择培养基分离法 1.直接分离：样品中目的菌含量多时。 2.加富分离：样品中目的菌含量少。,直接分离,富集分离,无对氨基苯甲酸，不生长,有对氨基苯甲酸，生长,二、菌种保藏技术 根据菌种特性和保藏目的进行保存。 1.原则 （1）选良种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢） （2）创造休眠环境如低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等。,2.几种常用保藏方法,3.菌种衰退、复
12、壮 （1）衰退 自发突变丢失优良生产性状、遗传标记。 原因：基因突变，传代过多。 衰退表现 菌落和细胞形态改变； 生长慢，产孢少； 抵抗力减弱； 代谢物产量或寄生力下降。, 防衰退方法 控制传代次数； 用不易衰退的细胞传代（如单核孢子）； 选合适培养条件及保藏方法； （2）复壮 狭义复壮:已衰退，找出未衰退个体。 广义复壮:未衰退前，进行纯种分离、生产性能测定提高性能。, 复壮措施 纯种分离：平板划线、涂布、单细胞挑取等。 接入寄主内复壮； 淘汰已衰退的个体（理化条件处理杀死衰退个体）。,4.国内外菌种保藏机构 （1）任务：收集、保管不死、不衰、不乱研究、交换和使用。 （2）菌种保藏机构： 中
13、国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,练 习 题,1.名词：生长因子、培养基、鉴别培养基、 选择培养基、水活度、加富培养基、衰退、复壮。 2.培养基的配制原则？ 3.配制培养基时为何调节pH？怎样调节？ 4.实验室常用来培养细菌、放线菌、霉菌的培养基及pH？ 5.如何筛选分解CMC的微生物？ 6.如何利用VB12专一性微生物对样品VB12的含量进行定量分析？ 7.能否仅凭借水解圈的直径和菌落的直径比来筛选高产胞外酶菌株？为什么？,8.常见的营养类型有哪些？对应的碳源、能源和氢供体各是什么？ 9.简述EMB培养基鉴别作用的原理。 10.如何用富集培养技术分离纯化分解石油的微生物？ 11.如何判断菌种是否衰退？若衰退，如何复壮？,
