微生物的生长繁殖及其控制课件

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1、第六章 微生物的生长繁殖及其控制,主要内容：,6.1 细菌个体生长,一、物质的复制DNA 1. 在细菌个体生长过程中，DNA以双向的方式进行复制. 2. 生长迅速的细菌中，新产生的子细胞中已 经有复制着的染色体DNA，即DNA复制与 细胞分裂并非同步。,1. 球形菌的细胞壁扩增方式：在赤道板附近插入； 2. 杆形菌的细胞壁扩增方式：新老细胞壁间隔分布； 3. 细胞壁扩增的分子基础：短肽中第三位双氨基氨基酸的作用。G菌：L赖氨酸；G菌：二氨基庚二酸 4. 作用于细胞壁的酶：,二、细胞壁的扩增,作用于双糖单位的：N乙酰葡萄糖胺酶和N乙酰胞壁酸酰胺酶 肽聚糖短肽链的：转肽酶、内肽酶和羧肽酶,三、细菌

2、生长与分裂调节,各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入，导致 横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。,对细菌生长与分裂起调节作用的主要是于转肽酶和D,D羧肽酶活性比。 转肽酶活性高些，利于CW扩增，导致细菌生长。 羧肽酶高些，利于横隔壁形成，导致细胞分裂。,6.2 微生物生长的测定,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,微生物生长,个体计数法通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量；,微生物生长的测定方法,生物量测定：重量测定、生理指标测定,1.个体计数法,A.直

3、接法,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点： 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,25X16型血球计数板,B.简接法,原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。,稀释平板计数法 先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30-300个之间 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖 肉眼可见的菌落 对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数,稀释平板计数法,涂布平板法 使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每支移液管及

4、涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液；,样品充分混匀；,每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数；,要求：,每ml活菌数同一稀释度平均数稀释倍数5 注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌,平板计数法,C. 比浊法 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度 (optical density, 即O.D.)表示菌量。 注意： 测量应在菌浓度与O.D.成正比的线性范围内，否则不准,2.重量法,通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。,以干重（105）、湿重直接衡量微生物群体的生物量；,蛋白质含量测定法从一定量培养物中分离出细菌，洗涤

5、，以除去培养基带入的含氮物质。再用凯氏定氮法法测定总含氮量。 一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%。故，蛋白质总量=含氮量%6.25 蛋白质含量占细菌总重的65，故细胞总量蛋白质总量1.54,DNA含量测定法：利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液)能显示特殊荧光反应的原理而设计的。因为每个细菌平均含DNA8.410-5纳克，可根据DNA含量计算出细菌的数量。,3.生理指标测定法,样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,微生物的生理指

6、标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。,6.3 细菌群体的生长繁殖,研究细菌群体培养的原因： 由于个体微小； 微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物的群体繁殖生长。,曲线特征：根据微生物每小时的分裂代数（R）不同，一般可把生长曲线分成迟缓期（延滞期）、对数生长期、稳定期、衰亡期。,一、细菌群体的生长规律,生长曲线：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,1. 迟缓期（lag phase）,生长速率常数等于零。 细胞形态变大或增长（巨大芽孢杆菌 接种3.4m，培

7、养5.5小时，19.8m） 胞内RNA尤其是rRNA含量增高; 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快）。 对外界不良条件（氯化钠浓度、温度）抗生素等反应敏感。,定义：少量微生物接种到新鲜培养基，开始的一段时间内数目不增加的时期。 特点：,采取缩短延迟期的措施： 在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量； 在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分 采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。,延迟期出现的原因：可能是为了调整代谢。当细胞接种到新的环境(如从固体培养接种至液体培养基)后，需要重新合成必需量的酶、辅酶或

8、某些中间代谢产物，以适应新的环境。,影响延迟期的因素：菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等。,定义：延滞期之后细胞以几何级数速度分裂的一段时期。 特点： 生长速率常数最大。细胞代时（分裂 一次）或倍增时间（原生质增加一倍）最短。 细胞平衡生长，菌体内各种成分最均匀。 酶活性活跃，代谢旺盛。,2. 对数期（logarithmic phase）,影响指数期微生物增代时间的因素:,菌种：不同菌种的代时差别极大,营养物浓度：营养物的浓度可影响微生物的生长速率和总生长量。,E.coli 肉汤中37 代时17分钟。 Nitro bacter.agilis 组合培养基中27 代时1200分钟 （活

9、化硝化杆菌）,E.coli 牛奶 37 12.5分钟。 肉汤中 37 17分钟。,营养成分：同一种细菌，在营养物丰富的培养基中生长，其代时较短，反之则长。,培养温度： 温度对微生物的生长速率有极其明显的影响,应用: 指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故 作为代谢、生理等研究的良好材料; 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄; 也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。,定义：对数期后，生长速率降为零的生长期。 特点：,（1）生长速率为零，新产生细胞数死亡细胞数。 （2）菌体产量（活菌数最大） （3）细胞开始贮存糖原、异染粒、脂肪；多数芽孢杆菌开始产生芽孢；有的微生物

10、开始合成次生代谢产物。,3. 稳定期（stationary phase）,原因： （1）营养物耗尽。 （2）营养的比例失调。 （3）有害代谢产物积累（酸、醇、H2O2 ） （4）pH值、氧化还原电势不适宜。,稳定期于生产上的意义： 生产菌体和与菌体平行生长的代谢产物（单细胞蛋白,乳酸）的最佳收获期。,定义：由于营养物耗尽，代谢产物积累，细菌死亡速 度大于新生速度的时期。特点： 细菌代谢活性降低； 细菌衰老并出现自溶； 产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素 菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊； 有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应,4. 衰亡期（decli

11、ne phase）,1. 同步培养与同步生长 同步培养：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。 同步生长：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态。,三、细菌的同步培养,同步培养的方法： 机械法：在不同生长阶段的细胞体积与质量或同某种材料结合能力不同 离心法（密度梯度离心）：处于同一生长期的细胞体积与质量相当。 过滤法： 使用孔径大小不同的滤器（微孔滤器） 硝酸纤维素滤膜法（Helmstetter-cummings技术） 同一生长期细菌与膜结合牢固程度相当。,获得同步生长的方法： 诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。

12、 选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,原理：细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,连续培养：指在微生物的整个培养期间，通过一定处理 使其能以恒定比生长速率生长并持续生长下去的培养方 法。 通过认识稳定期到来的原因，采取相应措施实现微生物 长期保持在指数生长平衡状态和稳定的生长速率。即对数生长后期，以一定速率补充新鲜培养液，再以同样速率移去培养物。,四、连续培养,连续培养两种类型： 恒化器连续培养、恒浊器连续培

13、养 恒化：某种营养物质维持恒定 恒浊：菌恒定,恒浊器连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低； 当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,连续发酵优点：,一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；,杂菌污染和菌种退化,缺点：,恒浊器连续培养,恒化器连续培养 使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最 高生长速率下进行生长繁殖。,限制性因子必须是机

14、体生长所必需的营养物质，如aa和氨等氮源，或G、麦芽糖等碳源或者是无机盐，一定浓度范围内决定细菌生长速率。,恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在 较低浓度，作为限制性因子，而其他营养物均过量。,两种连续培养器的比较,五、微生物的高密度培养,微生物的高密度培养指在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术. 现在报道的最高记录是:E. coli W3110的174g(湿重)/L; 高密度培养常用于重组蛋白质药物的生产; 主要的优势:节约成本.,选取最佳培养基成分和各成分含量 补料 提高溶解氧的浓度 防止有害代谢产物的生成,六、微生物培养法概论,实验室培养法; 生

15、产实践中微生物培养法;,实验室培养法,生产实践中微生物培养法,6.4 影响微生物生长的重要因素,生命的存在依赖于外界环境提供营养、水分、合适的环境因素（如：pH、氧化还原电位、温度、氧气）同时又受到外界环境因子的制约，二者是一致的。,一、营养 针对营养缺乏，微生物往往采取： 1、减少甚至停止合成细胞物质。 2、加速代谢（非必要成分或失效成分的降解）。 二、水 适宜的aw值。 aw值不同 造成渗透压不同 影响微生物生长速率,三、温度,根据最适温度的不同，可将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热、超嗜热； 各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。,温度对微生物的影响具体表

16、现在： 影响酶的活性 影响细胞质膜的流动性 影响物质的溶解度,最低生长温度 是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。 最适生长温度是指某微生物群体生长繁殖速度最快的温度，代时也最短。 最高生长温度 是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。 致死温度 最高生长温度若进一步升高，便可杀微生物。,上述“最适温度”仅是标定微生物繁殖最快的温度，实际上不同的生理生化过程有不同的最适温度（如下表）,1. 从微生物群体来看，pH范围很广，但绝大部分所需59的pH值。微生物对pH值的忍受范围也有最低、最适、最高三个数值点。用最适pH值与水比较，可把微生物区分为：,四、pH值,2. 与对温度的需求随生理生化过程的不同而异相仿，微生物的生理生化过程不同也要求不同的pH值。,极端pH环境下的微生物其内环境pH稳定，保持在7左右。细胞通过本身结构或生理过程来达到这一目的。 例子：嗜酸性微生物其CM可阻止过