微生物的生长与控制_1课件

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1、第七章 微生物的生长与控制,（一）细菌生长的定义和测定方法 个体和群体的关系 个体生长： 个体繁殖： 群体生长： 群体生长= 个体生长+ 个体繁殖 微生物学中的生长指群体生长,第一节 生长的定义和测定方法,生长(growth)：微生物在适宜的条件下，不断从周围环境中吸收营养物质转化为构成细胞物质的组分和结构，使个体细胞质量增加和体积增加，称为生长。 繁殖(reproduction)：细胞个体数目的增加称为繁殖。,（一）生长群体生长,（二）微生物的纯培养(pure culture),纯培养只有一种微生物生长的培养物。 将一个细胞或一群相同的细胞经过培养，繁殖得到的后代。 纯培养技术：把特定微生物

2、从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术。,获得微生物纯培养物的方法,稀释涂平板法 划线法 单细胞分离法 选择培养基分离法,（三）细菌生长的测定方法,细胞数量测定法 1. 活菌计数法（稀释平板计数法） 2. 滤膜测数法 3. 总细胞计数法（显微镜直接计数法） 4. 比浊法 细胞生物量测定法 5. 重量法 6. 生理指标法：C、P、RNA等,1.活菌计数法（稀释平板计数法）,常用来测定牛奶、食品、水及其它材料中的含菌数。 有些细菌如无法在固体培养基中生长或其他原因，可用液体稀释法，借助统计学来判断其活菌数。通过查MPN(Most Probable Number)来测知样品中活菌的可能数目。,

3、2.滤膜测数法（膜过滤培养法）,3. 显微镜直接计数法,4. 比浊法,5. 重量法,将单位体积培养液中的菌体，用清水洗净，然后放入干燥器内加热或减压干燥，最后测定其干重。 一般来说，干重约为湿重的1020%，即1mg干菌= 510mg湿菌= 45109个菌体。,6.氮量法(生理指标法),微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标。 如细菌含氮量约为菌体干重的14%。含氮量乘以6.25即可粗测出其蛋白质含量。其他方法测定耗氧量或其它代谢产物。,二、细菌的群体生长规律及生长曲线,细菌的生长曲线：将少量单细胞微生物纯培养菌种接种到一定体积新鲜的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定

4、菌体的数量，以菌数的对数为纵坐标，培养时间为横坐标，所绘成的曲线称为典型生长曲线。,迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期,1. 延迟期（迟缓期）,指少量微生物接种到新鲜培养基中，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。特点： 群体生长速度近于零 细胞重量增加，体积增大，但不分裂繁殖 细胞内RNA特别是rRNA增高，原生质嗜碱性 代谢活动特别是合成代谢旺盛 对外界不利条件反应敏感。,原因：合成新的代谢酶类，适应新环境。 影响延迟期长短因素：菌种、接种龄、接种量、培养基成分。,(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； (2)利用对数生长期的细胞作为种子； (3)尽量使接种前后所使用的培养基

5、组成不要相差太大； (4)适当扩大接种量,生产实践中缩短迟缓期的常用手段,2. 指数期（对数生长期）,菌数以几何级数增加；生长速率常数最大，代时最短而且稳定； 个体形态、化学组成、生理特性均较为一致； 酶系活跃，代谢旺盛。 了解细菌的代时（计算公式）,影响指数期微生物代时的因素：菌种、营养成分、营养物浓度、培养温度等。 对数生长期的微生物其个体形态，化学组成和生理特性等均较一致，代时稳定，代谢旺盛，生长迅速， 是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子。,3. 稳定期,又称最高生长期，此时微生物群体中新繁殖的细胞数目与死亡的细胞数目基本上处于平衡稳定的状态。 特点：生长速率等于0；菌体产

6、量达到最高。 稳定期后期产生芽孢,稳定期到来的原因,营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调； 有害代谢产物的累积； pH、氧化还原电位等物化条件越来越不适宜等。,4. 衰亡期,特点：细胞生活力衰退，死亡率增加，细菌总数急剧下降。细胞出现多形态；有的微生物出现自溶现象；有的会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；芽孢杆菌在这一时期会产生芽孢；？等等。 原因：外界环境对继续生长越来越不利，引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。,三、二次生长、同步生长和连续培养,（一）二次生长 （二）同步生长 （三）连续培养,微生物的高密度培养 （high cell-dens

7、ity culture, HCDC),高密度培养：指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养的10倍以上。 应用：基因工程菌生产多肽类药物，高密度培养时应注意：选取最佳培养基成分和含量；补料；提高溶解氧浓度；防止有害代谢产物生成。,四、真菌生长,真菌生长的表示方法 真菌液体培养时的生长形式 丝状真菌生长的三个阶段，各有什么特征,温度 水分和渗透压 酸碱度 氧和氧化还原电位 辐射 化学杀菌剂和抑菌剂,第二节 环境条件对微生物生长的影响,微生物可在-1095范围内生长。 极端下限-30，极端上限105300 但就具体微生物来讲，它只能在一定的温度范围内生长。 在这一定的温度范围内，每种微生物都有

8、自己的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。 在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。,一、温度,1.生长温度三基点,最低生长温度：生长繁殖的温度下限。 最高生长温度：生长繁殖的上限，此条件下，细胞容易衰老死亡。与胞内酶活性有关。 最适生长温度：生长繁殖速率最快，但不一定是一切代谢活动的最适温度，不等于最适发酵温度，也不等于积累某一代谢产物的最适温度。 乳酸链球菌：2530，细胞产量最高； 30 ，乳酸产量最高； 34 ，生长最快； 40 ，发酵速率最大。,致死温度：在10min内，杀死全部供试微生物的温度下限。 基质：生理盐水；浓度：每毫升108个细胞。 指

9、导意义：变温控制；消毒、灭菌的标准。,温度对微生物的生长具有双重影响,在一定的温度范围内，随着温度的上升，代谢活动逐渐旺盛，生长速度加快； 随着温度的上升，细胞内物质如蛋白质、酶、核酸等对温度比较敏感，逐渐变性失活。 微生物处于自己生长温度三基点之外是极为不利的。,微生物生长的温度类型,自学：嗜冷微生物、嗜温微生物、嗜热微生物是如何划分的 ？应用？ 低温对微生物的影响 高温对微生物的影响（放到第三节讲）,低温生长机制：酶的最适温度低；细胞膜中不饱和脂肪酸含量高 低温杀(抑)菌机制：低温下，水形成冰晶，损伤膜系统，造成细胞质泄漏，引发死亡。 菌种保藏：加保护剂（防止冰晶过大，降低细胞脱水），杜绝

10、反复冻融。 高温生长机制：酶、蛋白质对热稳定；细胞膜中饱和脂酸多。,二、氧气,1. 专性好氧菌（obligate aerobe） 必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。 绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌。 2. 兼性好氧菌（facultative aerobe） 又称兼性厌氧菌，有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下长得更好；有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶 许多酵母菌和许多细菌都是兼性好氧菌。,3. 微好氧菌（microaerophilicbacteria） 只能在较低的氧

11、分压下才能正常生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终受体而产能。 4. 耐氧菌（aerotolerant anaerobe） 可在分子氧存在下进行厌氧生活，生长不需要氧，分子氧对它也无毒害。不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。一般的乳酸菌多数是耐氧菌。,5. 厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它们有毒，即使短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死； 在固体或半固体培养基深层才能生长； 生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供； 细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,专性好氧菌,兼性厌氧菌,耐氧菌,专

12、性厌氧菌,微好氧菌,为什么氧气存在能够抑制甚至杀死厌氧菌？ 氧气进入菌体后，能接受电子而产生不同还原性的氧离子，如过氧离子、过氧化物自由基。过氧化物自由基和过氧离子都是很强的氧化剂，对微生物有毒，能氧化微生物过程中所必需的酶。 好氧菌、兼性需氧菌以及微量需氧菌体内含有过氧化物歧化酶（SOD)和过氧化氢酶。这两种酶能将过氧化物自由基和过氧离子还原成没有毒性的水分子，所以它们不会被氧气所杀死。耐氧菌虽没有过氧化氢酶，但有过氧化物酶，能合成SOD，而不会被氧毒害。 厌氧菌体内都没有这些酶，所以不能忍受氧气。,超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase；SOD ）,催化超氧化物自由基O

13、2和氢离子反应形成过氧化氢和分子氧的酶。EC 1.15.1.1。 SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。 SOD是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到,1969年McCord等重新发现SOD，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。 SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。 全球118位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。体内的

14、SOD活性越高，寿命就越长。,是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。 SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。 SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞， 由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！,自由基（Free Radical）是一类非常活跃的化学物质，是个有不成对（奇数）电子的原子、原子团、分子和离子。 最重要的是氧自由基，它可聚集在体表、心

15、脏、血管、肝脏和脑细胞中。如果它沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化，高血压，心肌梗塞；沉积在脑细胞时，会引起老年人神经官能不全，导致记忆、智力障碍以及抑郁症，甚至老年性痴呆等，是造成人类衰老和疾病的元凶。,耐热SOD是国家“十五”、“十一五”863计划重大课题项目（课题编号：2004AA214080、2007AA100604）， 由中国科学院国家重点实验室采用先进生物发酵技术，历时八年开发出来的新一代SOD酶产品（专利号：ZL200510005207.9）。,SOD学说：1971年McCord & Fridovich,三、pH,pH值对微生物的生长繁殖影响很大。 从微生物界

16、整体来看，pH值在59范围内，较易生长。少数pH2.0或10.0能生长 对每种具体的微生物来讲，只能在一定的pH值范围内生长。 生长pH三基点：最低pH值、最适pH值和最高pH值。,1. 微生物生长繁殖的pH值,细菌、藻类、原生动物pH范围4.010.0最适的pH在6.57.5； 放线菌的最适pH在7.08.0； 酵母菌在3.86.0； 霉菌的最适pH值在4.05.8。,2. pH值对微生物生长的影响,影响细胞膜的电荷，从而影响微生物对营养物质的吸收； 影响代谢过程中酶的活性，从而影响微生物的生命活动。,微生物在不同的生理阶段有不同的最适pH值,发酵工业中通过控制pH值来达到预期的目的。 黑曲霉进行发酵： pH值在23时，主要产物是柠檬酸 pH值接近中性时，则产生大量草酸。,3. 微生物的生长对环境pH值的影响,微生物在生长过程中，由于代谢作用，会产生酸性或碱性的代谢物，从而改变培养基或周围环境的pH值，影响微生物生命活动的正常进行。 为避免pH值大幅度改变，添加缓冲剂或加入