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1、第七章 体液蛋白质检验,本章内容概要,第一节 概述 第二节 血清总蛋白测定 第三节 血清清蛋白测定 第四季 血浆纤维蛋白原测定 第五节 血清粘蛋白测定 第六节 其他体液蛋白质测定 第七节 血清蛋白电泳分析,本章教学要求,掌握 血清总蛋白测定、血清清蛋白测定、醋酸纤维素薄膜电泳测定血清蛋白 熟悉 血浆蛋白质的测定方法及评价、血浆纤维蛋白原测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳测定血清蛋白 了解 血浆蛋白质的生理功能、血清粘蛋白测定、其他体液蛋白质测定,第一节 概述,机体蛋白质：,体液蛋白质的检测：,机体主要的 生物大分子,含量：人体固体成分的45%,种类：10万，30005000种/单细胞,功能：生长，代谢、
2、血凝、运动、免疫、信息传递等,疾病发生,体液蛋白质异常,要判断异常,首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能及分类及特点,一、血浆蛋白质的组成、功能及分类,组成：,种类：1000种 500种 200种 含量：g mg g 来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂,功能：,（1）营养作用，修补组织蛋白，供能； （2）维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持75%80%的血浆渗透压，作用是促使组织液回流入血，维持血管内外的水平衡； （3）运输作用：作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体； （4）作为PH缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质，血浆PH7.35-7.45； （5）体液免疫防御系统：作为免疫球蛋白与
3、补体等免疫分子； （6）参与凝血与纤维蛋白溶解；除因子外均可 （7）催化作用：酶的本质； （8）其他生理功能：代谢调控作用，作为底物，酶或中间产物抑制或激活组织蛋白酶,分类：,依据来源、分离方法和生理功能,来源,肝生成：绝大多数血浆蛋白质,其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素,分离方法,盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）,电泳法：,醋酸纤维素薄膜电泳：6种,琼脂糖凝胶电泳：13种,聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种,SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种,分辨率增高,-,-,-,+,纤维蛋白原,醋酸纤维素薄膜,二、血浆蛋白质的测定方法及评价,测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白
4、质以下的结构或性质,1、元素组成测定：含N稳定； 2、重复的肽链结构：具有多个肽键； 3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色或UV 吸收； 4、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接； 5、沉淀后借浊度测定：光度计测定； 6、光折射测定：折射仪测定。,方法 化学法 凯氏定氮法参考方法， 双缩脲法( 推荐)，酚试剂法，比浊法 物理法 电泳法、紫外分光光度法 染料结合法 免疫化学法,根据蛋白质平均含氮量16%计算蛋白浓度,凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro),消化 用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时） 蒸馏 用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发； 吸收 用酸性溶液
5、（硼酸）吸收气态氨（使H+ ） 滴定 用已标定的无机酸滴（使H+ 恢复），计算总氮量 定蛋白（总氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,原理：,评价：,优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。 缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。,应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法（参考方法）,双缩脲法,原理：,蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。,条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以
6、上才能反应。,双缩脲生成,评价：,优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%2%，显色稳定。 缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。,应用：常规推荐方法。手工或上机使用。,酚试剂法,原理：,蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，,Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。,评价及应用：,优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-60g），适合测定蛋白含量少的标本。 缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物
7、干扰。,比浊法,原理：,评价及应用：,优点：简便不需特殊仪器。 缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）,某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。,电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂凝胶电泳可将血清蛋白质分为清蛋白、1、2、-球蛋白无部分。 评价 特异性好，了解蛋白质全貌的有价值方法 电泳技术操作繁琐、费时、不易自动化,紫外分光光度法,蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45
8、 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260,原理：,评价及应用：,优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。 缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。 措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。,染料结合法,在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变
9、，可既而用分光光度法比色测定。,原理：,常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等,评价及应用：,优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。 缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。,免疫化学法 原理：血浆蛋白质具有抗原性，利用抗原和抗体的高度特异性反应，形成抗原-抗体复合物，再经过显色的深浅测定浓度 有免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫电泳法 优点：定量测定个别蛋白质，特异性好、灵敏度高 缺点：成本高,第二节 血清总蛋白测定,原理,这种紫红色络合物在540nm处的吸光度值与蛋白质的含量在10120g/L范围内呈正比关系，与经过同样处理的蛋白质标准液比较，即可求出蛋
10、白含量。,540nm ,条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反 应,三肽以上才能反应。,参考范围：成人6080g/L,临床意义：,总蛋白升高：,总蛋白降低：丢失过多 吸收不足、消耗增加 白蛋白合成减少 血浆被稀释,真性升高：骨髓瘤、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病,假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高， A/G几乎不变,第三节 血清清蛋白测定,ALB由肝实质细胞合成， 分子量66458， pI4-5.8， 血浆中半衰期15-19天， 是血浆中含量最多的蛋白质，约40%-60%,电泳法 特异性好，可了解血清蛋白质全貌但电泳技术繁琐；白蛋白与染料亲和力
11、高会导致结果偏高。 免疫化学法 特异性好，灵敏度高，适用于尿液和脑脊液中微量清蛋白测定。,染料结合法: 主要依据清蛋白可与溴甲酚绿（BCG）和溴甲酚紫（BCP）结合的特性，而球蛋白几乎不结合或结合上述染料很慢，故临床自动化分析中通过缩短反应时间来去除干扰。,溴甲酚紫法（BCP）： 在pH5.2的缓冲液中，有Brij-35(聚环氧乙烯月桂酰醚)存在的情况下，溴甲酚紫（BCP)可与清蛋白结合形成绿色复合物，在603nm波长处的吸光度值与清蛋白的浓度成正比,溴甲酚绿法（）： 血清清蛋白在pH4.2的缓冲液中带有正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（BCG）形成蓝绿色复合物，在628nm处有特殊的吸收峰，其颜色的深浅与清蛋白的浓度成正比。,参考范围:成人3555g/L.,临床意义：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丢失过多 消耗增加 白蛋白合成减少 水肿 先天性Alb缺乏病,真性升高：未见,假性升高：机体明显失水，或治疗 输入过多白蛋白,
