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1、1,中药比较药代动力学研究思路与应用,宋敏 博士 副教授 药物分析教研室 中国药科大学,2,中药研究现状,中药研究热点：质量控制、药效物质基础 质量控制： DNA分子标记技术建立部分动物药的鉴别方法 采用生物自显影技术、细胞膜技术、生物活性测定等生物方法建立药材的定性鉴别和定量分析方法 采用“一标多测”技术建立多成分含量测定方法； 采用指纹图谱分析法建立部分药材的整体质量控制方法 -逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡,3,中药药代动力学药效物质基础研究 目前，研究手段大多与化学药物相类似，针对已知活性成分单体进行研究，但单味中药即是一个化学分子库，且有效成分不
2、甚明确，相互间可能存在的影响关系不明确。 the kava extract increased the oral bioavailability of kawain in rat which was also the main cause of the adverse drug reaction Pharmacokinetics and disposition of the kavalactone kawain:interaction with kava extract and kavalactones in vivo and invitro. Drug. Metab. Dispos. 200
3、5, 33, 15551563.,中药药代动力学研究现状,4,中药药代动力学药效物质基础研究 中药中化学成分存在相互影响 The coexisting ingredients in Gentiana manshurica had remarkable influence on the pharmacokinetics of gentiopicrin Studies on pharmacokinetics of gentiopicrin in longdan and its compound preparation in rats. Chin. Pharm. J. 2003, 40, 21221
4、5.,中药药代动力学研究现状,5,中药药代动力学,有效成份单体与其在中药提取物中的体内过程并不一致，势必在药理作用上得以体现 Such as dihydrotanshinone and cryptotanshinone were less active in acetylcholinesterase inhibitory when isolated Ren, Y.H., Peter, J.H., Robert, C.H., Melanie-Jayne, R.H., 2004. Novel diterpenoid acetylcholinesterase inhibitors from Salv
5、ia miltiorrhiza. Planta Med. 2004, 70, 201204.,6,中药药代动力学,药理作用差异 salvinolic acid B, which is the main hydrophilic component in S. miltiorrhiza Bge., showed lower effective concentration in in vitro angiogenesis study than the crude extract Crude extract of Salvia miltiorrhiza and salvianolic acid B e
6、nhance in vitro angiogenesis in murine SVR endothelial cell line. Planta Med. 2003, 69, 26-32 中草药间的相互配伍反应及与其他药物的相互作用日益得到重视，但仍需进一步研究,7,挖掘丹参药材中共存组份之间可能存在的相互影响情况，认识丹参药效物质基础，为临床用药提供指导，为新药开发提供理论依据。,第一部分 丹参提取物有效成分比较药代动力学,8,第一部分 丹参提取物有效成分比较药代动力学,丹参水溶性成分 丹参酯溶性成分,9,丹参水溶性成分:丹酚酸B和原儿茶醛,丹酚酸B：丹参水溶性成分中含量最高和药典规定的含量
7、测定指标成分。 原儿茶醛：丹酚酸B在体外可能的降解产物。,10,实验条件,Thermo Finnigan Surveyor LC-TSQ Quantum Ultra AM液相色谱串联四极质谱系统(美国菲尼根质谱公司)。 色谱柱：Waters-C18 250mm4.6mm, 5m (预柱为C18,10mm4.6mm, 5m)； 流动相：甲醇(A)1冰乙酸(B) 为流动相， 梯度洗脱：0min(40A)-4min(40A)-4.1min(80A)-10min(80A) ； 流速：1.0mLmin-1，柱后分流，0.3 mLmin-1进入质谱检测器 ； 进样量：20l。,一、原儿茶醛的药动学研究,1
8、1,质谱图,Mass spectra of protocatechualdehyde (A) and internal guaiacol (B),A,B,12,A: Blank plasma B: Protocatechualdehyde added to blank plasma, C protocatechualdehyde =200.0ngml-1 (tR=4.90min) C: Rat plasma sample taken 20min after ig of protocatechualdehyde, C protocatechualdehyde =1002.7ngml-1 (tR=
9、4.89min),A,B,C,13,药动学试验设计,Sprague-Dawley大鼠6只，雌雄各半，体重25010g，由南京医科大学动物实验中心提供。大鼠于受试的前晚起禁食，不禁水，于灌药4小时后给食。大鼠灌胃给药原儿茶醛62 mgkg-1。分别于给药后2、5、10、15、20、30、40min和 1.0、1.5、2.0、3.0h从眼底静脉丛取血0.5mL，置肝素钠抗凝处理过的试管中，3000 rmin-1离心10min，转移血浆，置-20保存待测。,14,原儿茶醛药时曲线,Mean plasma concentration-time curve after ig protocatechual
10、dehyde 62mgkg-1 in rat,达峰时间在1015min，而后以极快的速度消除，180min后只能测到少数大鼠的血药浓度。,15,色谱条件与质谱条件,质谱条件 丹酚酸B是三分子丹参素和一分子咖啡酸的缩合物，虽然在负离子监测模式下也可生成m/z717的M-H-，继而经二级碰撞脱去一分子丹参素产生子离子m/z519M-198-H-，但在相同的碰撞能量下也可生成脱去两分子丹参素的子离子m/z321，两者丰度相差不大，不够稳定如图所示；相比较正离子监测模式下M+Na峰m/z741较稳定，且其子离子m/z561为脱去一分子咖啡酸后生成，丰度较强，因此被选用。,A,B,Negative mo
11、de; B. Positive mode,二、丹酚酸B的药动学研究,16,丹酚酸B在大鼠体内的药时曲线,Mean plasma concentration-time curve of salvianolic acid B after ig. salvianolic acid B 260mgkg-1 in rat,17,三、丹参水溶性提取物的中 丹酚酸B和原儿茶醛的药动学,灌胃试液的配制： 取丹参干燥药材粉末500g，水1000mL提取三次，每次1hour，过滤后滤液浓缩，再分别用60%, 85%和95%的乙醇沉淀鞣质，过滤，滤液减压浓缩至干，用适量生理盐水溶液即得，HPLC-UV测定其中丹酚酸
12、B含量为26mg/mL，原儿茶醛为6.2mg/mL。,18,血药浓度经时过程,大鼠灌胃给药丹参水提物 （其中相当于丹酚酸B 260mgkg-1和原儿茶醛62mgkg-1）后的丹酚酸B和原儿茶醛的药时曲线。,Mean plasma concentration-time profiles of salvianolic acid B and protocatechualdehyde in rat after ig of Danshen water soluble extract,19,小结与讨论,原儿茶醛：大鼠灌胃给药原儿茶醛单体后的AUC为64754.0 ng/mlmin，而灌胃给药含有相同含量原
13、儿茶醛的丹参水提物后，其AUC只有25067.9 ng/mlmin，即单体给药的AUC为提取物给药的2.6倍，Cmax为5.1倍，MRT为0.4倍，可见原儿茶醛单体给药时吸收较好，而消除快；以提取物方式给药后的原儿茶醛呈一房室模型，即只在中央室少量吸收，未向周边室分布就开始消除。,Comparison of the plasma concentration-time profiles of protocatechualdehyde,20,小结与讨论,丹酚酸B：以提取物方式给药后的丹酚酸B的AUC为98904.3 ng/mlmin，是单体方式给药后的AUC(为22569.4 ng/mlmin)的
14、4.4倍，Cmax为3.4倍，MRT为1.5倍，即提取物方式给药使丹酚酸B的吸收变好了，消除减慢了。可能的原因包括提取物中的并存成分促进了丹酚酸B的吸收并减缓其消除，或其它成分的代谢转化。,Comparison of the plasma concentration-time profiles of salvianolic acid B,21,小 结,经过大鼠原儿茶醛和丹酚酸B的药动学比较研究可知，丹参药材水溶性提取物中的其他组份可直接影响原儿茶醛和丹酚酸B的吸收及消除，分别对它们产生抑制和促进作用。因此，利用中药中含有的“标志成分”的纯品（或标准品）进行药动学研究是必要的，这也是目前中药药动
15、学研究的重要方法，可以提供较好的参考，但却不能以此代替中药材提取物或中药复方制剂（更复杂）的药动学研究。,22,丹参脂溶性成分的大鼠药代动力学研究,同时分析检测7个活性成分，获得其中5个成分的大鼠体内的经时过程,Mean ratio-time profile of several compounds in Danshen acetic ether extract,23,药代动力学试验设计,Sprague-Dawley大鼠18只，平分为3组，每组雌雄各半，体重25010g，大鼠于受试的前晚起禁食，不禁水，于给药4小时后进食。3组大鼠分别灌胃给药 丹参酮A单体8.0mgkg-1 隐丹参酮单体5.7
16、mgkg-1 丹参脂溶性提取物 （相当于分别含隐丹参酮、丹参酮A为5.7和8.0 mgkg-1） 分别于给药后5、10、15、20、30、40min和 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0h从眼底静脉丛取血0.5mL，置肝素钠抗凝处理过的试管中，3000 rmin-1离心10min，转移血浆，置-20保存待测。,24,药代动力学结果-1,Mean concentrationtime profiles of cryptotanshinone in rat plasma after intra-gavage of cryptotanshinone (5.7 mg/kg) and tanshinones extract (23.3 mg/kg) (meanS.D., n = 6). The Cmax and AUC were significantly different (P 0.001).,25,Mean concentrationtime profiles
