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1、一 概述： 病理学在经历了几个阶段 器官病理学 组织病理学 细胞病理学 免疫病理学,随着50年代DNA双螺旋结构的发现，有关人类遗传物质，基因的研究进入了分子时代。肿瘤基因和病毒基因研究的新发现，特别是细胞分子生物学基础理论和技术方法出现了革命性的创新并日益完善成熟，使人类生物医学进入了分子水平时代。病理学的发展也不例外，将病理学这门有着悠久历史的学科推进到分子水平，逐步形成了分子病理学。病理学诊断也由以形态学观察为基础逐步进入分子水平，既分子诊断,分子病理学： 应用细胞分子生物学的理论和技术方法，对人类疾病发生发展、发病原因、机制、疾病的形态变化从分子or基因水平加以认识。 病理学诊断也由以
2、形态学观察为基础逐步进入分子水平，既分子诊断以探查基因的变化来达到诊断疾病的目的。,分子诊断的特点： 灵敏度高：基因虽然微量，难以检测，但目前已有使用基因or其片段高度扩增的PCR技术，以及应用高灵敏度的基因探针，即可探测。 特异性强：基因诊断检测的目标是基因，不同的基因的碱基序列各不相同，检测基因的分子生物学方法亦是高度特异性的。 适用范围广。,目前主要应用于： 人类遗传病的基因诊断or产前诊断；肿瘤； 感染性疾病病原体（细菌，病毒）； 多基因病；组织器官移植配型； 法医学个人识别（个人特异性的DNA指纹图）； 亲子鉴定。 其中肿瘤的分子诊断涉及到，多种恶性肿瘤、癌前病变。 诊断的基因涉及多
3、种癌基因，抑癌基因及相关基因。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 1 肿瘤易感基因的检测： 肿瘤分子遗传学研究发现，部分肿瘤的发生具有 遗传学基础，故肿瘤遗传相关的易感基因检测对 于肿瘤高危人群的筛测具有实用价值。 已明确的肿瘤易感基因及相关肿瘤有：,Rb1-视网膜母细胞瘤，为抑癌基因，定位于13q14.1 染色体, 基因产物位于细胞核。 APC-家族性腺瘤性息肉病，该基因定位于5q21染色体, 基因产物位于细胞膜，功能不清。 WT1-肾母细胞瘤，该基因定位于11p13染色体, 基因产 物位于细胞核。 BRCA1-乳腺癌，卵巢癌等，该基因定位于17q21染色体, 基因产物位于细胞核，为核内
4、磷酸化蛋白与激素信 号传导有关。,抑癌基因与相关肿瘤 抑癌 染色体 基因产 遗传性肿瘤 散发性肿瘤 基因 定位 物定位 Rb 13q14 核内 视网膜母细胞瘤 视网膜母细胞瘤 膀胱癌 乳癌 食道癌 肺癌 P53 17p13 核内 膀胱癌 乳腺癌 食道癌 肺癌 肝癌 卵巢癌 淋巴瘤 DCC 18q12 胞膜 结肠癌 直肠癌 APC 5q21 胞浆 家族性多发性腺瘤 结肠癌 直肠癌 胃癌 胰腺癌 WT1 11p13 核内 Wilms瘤 Wilms瘤 P16 9q21 核内 黑色素瘤 黑色素瘤 膀胱癌 乳腺癌 肺癌 肾癌 卵巢癌 BRCA1 17q21 胞浆 乳腺癌 卵巢癌 乳腺癌 卵巢癌 结肠癌
5、直肠癌 前列腺癌,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 2 肿瘤的分类： 对BCR区基因重排的检测，可对慢性粒细胞性白学病进行诊断，该基因定位于22q染色体, 该基因称为断裂点群区域基因，9q上的AB1基因与22q34.36区域基因序列相融合。 对N-myc和C-myc的扩增和表达检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值。N-myc明显扩增和过度表达-神经母细胞瘤。C-myc的扩增和过度表达-神经上皮细胞瘤。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 3 肿瘤的早期诊断： K-Ras基因突变，在胰腺癌，结肠癌，肺癌中发生率较高，其突变点在第12编码子最常见。应用针吸活检检测胰腺癌中第12编
6、码子突变，检出率达100%。 应用PCR-RFLP(限制性酶切片段长度多态性）方法检测了结肠癌患者Ras基因突变达33.3%. 另有学者检测了有Ras基因突变的7例中，1例病人随访4年后发现了结肠癌。 K-Ras基因编码鸟苷酸结合蛋白，与GTPase结合。其突变降低了Ras蛋白与GTPase的结合能力，导致Ras蛋白与GTP的持续结合，从而促进细胞的生长作用。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 4 肿瘤的预后判断： 肿瘤相关基因的突变，扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关。如，P53基因突变与乳腺癌，肝癌，结肠癌等多种肿瘤预后相关。 P53基因位于17p13，基因产物定位于细胞核，编码
7、393个氨基酸组成的53KD的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能，p53是细胞周期中负调节因子，与细胞周期的调控，DNA修复，细胞分化，细胞凋亡等生物学功能有关。,肿瘤转移抑制基因nm23的表达水平与肿瘤转移相关。 Nm23位于17q22，基因产物定位于细胞浆，基因功能 目前认为主要有以下几个方面： A,通过抑制细胞对血小板源性生长因子，胰岛素样生长因子-1反应而影响细胞运动和抑制肿瘤转移； B,通过影响细胞内微丝、微管与细胞骨架系统的聚合/解聚和G蛋白介导的信号传导，参与细胞周期的调控而调节癌细胞的转移潜能； C,nm23基因上调c-myc，促进转录发生，并调节肿瘤
8、细胞与微环境的反应，促进基底膜形成而抑制肿瘤细胞生长和转移。 CerbB-2基因的过表达与乳腺癌预后相关。 上皮生长因子受体，为磷酸化蛋白。,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 5 肿瘤的预见性治疗： 肿瘤的发生是多基因，多步骤，多阶段的过程。在肿瘤发生，发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式，与肿瘤临床治疗敏感性密切关联。如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，则对肿瘤的预见性治疗具有指导意义。如90%的胰腺癌，50%的结肠癌，30%的非小细胞肺癌存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常的基因状态，则可提高放疗敏感性。,起动阶段 促进阶段 进展阶段 正常
9、胃粘膜萎缩性胃炎肠化异型增生原位癌转移癌 基因点突变 基因扩增 基因缺失 or过量表达 or重排 Ras, P53 erbB2, EGFR Apc,P53, P16, Rb, nm23,二 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用 6 肿瘤的预后监测： 如用多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术可使白血病细胞检出率达到1/106左右，应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。分子诊断在肿瘤的监测方面具有重要意义。 肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因，抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质，RNA和DNA水平进行判断。,三 肿瘤基因过表达
10、及其检测 1 基因过表达的形式： 癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中的关键因素，癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为形式之一。 癌基因一般为单拷贝基因，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多拷贝，这种基因的扩增，使得基因过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。 抑癌基因在正常情况下维持细胞的正常周期。 P53其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后起到癌基因的作用。其产物半衰期延长，应用一定的方法即可在肿瘤细胞内检测到过表达的P53蛋白。,人类肿瘤中的癌基因扩增 癌基因 肿瘤及扩增百分比（%） C-myc 乳腺癌(15-23), 结肠癌(3-6) 肺鳞状细
11、胞癌(12-25) N-myc 神经母细胞瘤(10-31) c-myc, N-myc or L-myc 肺小细胞癌(11-23) C-myc or L-myc 肺腺癌(2-11) ErbB-2 乳腺癌(16-33), 胃癌和食道癌(5-13), 卵巢癌(20-33) K-ras 乳腺癌(3), 卵巢癌(4-8), 肺癌(4),几种常见肿瘤癌基因的扩增率 基因 肿瘤类型 扩增率(%) 基因 肿瘤类型 扩增率(%) C-erbB-2 乳腺癌 16-33 N-Myc 肺腺癌 2-11 胃，食道癌 5-13 K-Ras 乳腺癌 3-10 卵巢癌 20-33 胰腺癌 45 胆囊癌 45-58 卵巢癌 8
12、-8 肝癌 25-45 胆囊癌 30-61 C-Myc 乳腺癌 25-30 N-Ras 肝癌 24 结，直肠癌 3-6 胆囊癌 40-60 肝癌 25-42 肺鳞癌 15-25,2 基因过表达的检测： 1） 表达产物的检测： 癌基因，抑癌基因其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，通过免疫组织化学（Immunohistochemistry）方法检测肿瘤组织中蛋白产物，or蛋白印迹(Western Blot)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测肿瘤细胞or血清中的蛋白产物。 免疫组化：在组织切片上进行。Or细胞爬片。 特点-是保持组织结构的条件下原位进行分析。 ELISA是在细胞悬液中进行。
13、,Western blot 既可对组织细胞进行分析，也可对释放至血液中的蛋白质进行检测。 流式细胞仪（Flow cytometry） 新一代测定蛋白质产物的方法,首先标记荧光于相应的抗体蛋白，与含有特异性抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对不同荧光信号的细胞进行分类、测试。 在已报道的研究结果中，许多肿瘤都存在其相关基因的蛋白产物过表达。如乳腺癌C-erbB-2表达，阳性率50%，P53 为50%，并与其组织学类型、浸润、转移倾向和预后有关。P53基因产物在大多数肿瘤中都有过表达，包括胃癌，直肠癌，肺癌，食道癌，肝癌，卵巢癌等。,2）基因扩增的检测： 肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外表现为
14、基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，可通过分子诊断方法进行检测。 经典的方法： 核酸分子杂交原位杂交 （In situ hybridization,ISH） Southern blot(DNA杂交)，Northern blot(RNA杂交)， 原位PCR，反转录PCR。,核酸分子杂交： 是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补顺序，即可按碱基配对规则以氢键相结合。通常是先对一种核酸进行标记（如放射性同位素or荧光素、生物素等）作为探针，去探测另一核酸序列。先经过变性使DNA双链分开成单链，再进行杂交，可以是DNA-DNA, RNA-RNA, or D
15、NA-RNA之间进行。,原位杂交： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。 用原位杂交技术检测肿瘤细胞内癌基因的mRNA可检出激活的癌基因。用不同种类的癌基因探针检测同一种癌组织内mRNA可以明确有哪些基因被激活。,Southern blot： 1975年由Southern提出并以其名字命名的一种DNA特定序列定位技术。 基本原理从组织细胞中提取基因组DNA，用一种or多种限制性内切酶酶切，通过电泳，转膜，原位变性固定于固相支持物（硝酸纤维滤膜or尼龙膜），用已标记的特异性DNA or RNA探针与固定有DNA的固相支持物杂交，经放射自显影or化学发光自显影，对显影条带进行分析。可以确定在众多酶解产物中某一特定序列DNA片段的位置和大小。最常见的研究对象为基因组DNA，也可以用于质粒DNA的片段分析。,Northern blot： 1977年Alwine等提出的一种类似于Southern的方法，主要用于分析mRNA。 基本程序提取组织细
