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1、细菌感染的病原学诊断,第一节 临床标本的采集与处理,一、 标本采集的一般原则： （一）早期采集,三前,明显症状出现前,未使用抗菌药物之前,如已用抗生 素,应停 用12天,未出现合并或继发感染之前,（二）无菌采集，避免污染 （三）不同病菌、不同疾病、采集不同标本 如: 伤寒 第一周 取血 第二、三周 取大、小便、骨髓 （四）根据检测项目的要求，应采集足量 （五）安全采集：避免标本污染；防止传播和自身感染 （六）标本应注明：姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检测项目,二、标本处理原则 1、床旁接种 2、立即送检：一般在2小时内 3、保温（低温、嗜温）送检 4、保护送检：避免打翻、破流、污染、漏
2、气。 5、安全送检：烈性传染病标本，专人送检。,三、标本的检查方法 1、直接显微镜检测 2、病原体的分离培养和鉴定 3、病原体特异性抗原检测 4、血清学检测（特异性抗体检测） 5、病原体核酸检测,第二节 细菌的形态学检查,细菌的形态学检查是细菌检验中最主要的基本方法之一。 工具必备的基本工具(显微镜)。 方法不染色标本检查和染色标本检查。,（一）不染色标本检查法 主要用于观察生活状态下微生物某些形态特点及运动性 常用的方法有压滴法和悬滴法 如:用压滴法观察霍乱弧菌的“鱼群样运动” 悬滴法观察霍乱弧菌的“穿梭样运动” 如在同一方法制作的另一标本中加入效价1:64霍乱多价血清则穿梭样运动停止并发生
3、凝集,则为制动试验(+),一、检查方法,悬滴法制片的步骤,暗视野检查 用于检查活菌、螺旋体及其动力 缺点是不能观察结构，不能鉴别染色性,（二）染色标本检查法 1、常用的染料有 (1)碱性染料：显色离子带正电，易与带负电的病原体结合，如碱性复红、结晶紫、美兰。 (2)酸性染料：显色离子带负电，易与带正电的病原体结合，如伊红、刚果红。 (3)复合染料：又称中性染料，是酸、碱性染料的复合物，如伊红美兰、姬姆萨染料、荧光染料。,2、染色标本的检查,染色,单染,复染,正染,负染 (negative staining),革兰染色法,抗酸染色法,荧光染色,单染色:只用一种染料进行染色.,可分为: 正染:标本
4、着色,背景不着色 负染:标本不着色,背景着色,用于形态的观察,不能鉴别染色性,如：白喉杆菌美兰染色,复染色:用两种或两种以上的染料进行 染色,目前常用的有:革兰染色法、抗酸染 色法、荧光染色、特殊染色法,既可观察形态结构,又可鉴别染色性,革兰染色法步骤:,制片: 涂片,染色:,结晶紫初染1分钟,水冲洗,碘液媒染1分钟,水冲洗,95%乙醇脱色30秒左右,水冲洗,稀释复红复染30秒,水冲洗,干后油镜下观察,干燥,固定,结果: 染成紫色称革兰染色阳性 G+ 染成红色称革兰染色阴性 G-,原理: (1)等电点学说 结晶紫为碱性染料,(2)化学学说 G+含有核糖核酸镁盐,能与结晶紫形成牢固的复合物,(3
5、)通透性学说,G+ G-,P I 23 46,核糖核酸镁盐 + -,通透性 小 大,脂质 少 多,意义 : (1)鉴别细菌，有助于进一步鉴定。对有特殊形态结构及排列方式的病原菌可进行初步鉴定。 (2)指导临床用药 (3)了解细菌的致病性,特殊染色法:,1、鞭毛染色法: 2、荚膜染色法: 3、芽胞染色法:,第三节 细菌的分离培养 培养基： 概 念：是由人工配制的适合微生物生长繁殖使用的混合营养基质。 应有成分： 水份 碳源 氮源 能源 无机盐 生长因子,分为三大类,营养物质,凝固物质,抑制剂和指示剂,培养基的组成成分: 1、营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子等 （1）蛋白胨：是最常用的成分之
6、一，提供细菌生长繁殖所需的氮源；含胨、多肽和多种氨基酸。其吸水性强，应密封干燥保存。 （2）肉汤：提供细菌生长繁殖所需的氮源和碳源及少量生长因子。,（3）牛肉浸膏：由肉浸液经长时间加热浓缩而制成。糖类在加热过程中被破坏，所以其营养价值低于肉浸液，常用于制备培养基。 （4）糖类、醇类：为细菌生长提供碳源和能源。除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。,（5）血液：血液中既含有蛋白质、多种氨基酸、糖类、无机盐类等营养物质，又能提供辅酶（如V因子）、血红素（X因子）等特殊生长因子。,（6）无机盐类：提供细菌生长的各种元素，如：钾、钠、铁、硫等。用于
7、制备培养基的无机盐类有多种，其中最常用的有氯化钠和磷酸盐，前者可维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压，后者是细菌良好的碳源并具缓冲作用。,（7）鸡蛋和动物血清:虽然不是构成培养基的基本成分,但却是某些细菌生长所必需的营养物质,所以仅用于制备一些特殊的培养基。 （8）生长因子：是细菌生长所必需的，但需要量很小。在制备培养基时，常加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。,2.凝固物质 制备固体培养基时，需在液体中加入凝固物质，最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。 3.抑制剂和指示剂 它们并不是细菌生长繁殖所必需的物质，而是由于选择、鉴定及判断结果的需要。,（1）抑制剂：
8、在制备培养基时，加入一定种类的抑制剂，目的在于抑制非检出菌的生长，以利于检出菌的生长。常用的抑制剂有胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素。,（2）指示剂：便于观察细菌是否利用和分解培养基中的糖、醇类。常用的有酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、中国蓝等酸碱指示剂。美蓝常用作氧化还原指示剂。, 种 类：,按成分不同分为,天然培养基,合成培养基,半合成培养基,按用途分为,基础培养基,营养培养基,鉴别培养基,选择培养基,特殊培养基,(二)培养基种类 1.基础培养基 含有细菌基础生长所需的基本营养成分，主要成分是肉汤和蛋白胨。广泛用于细菌和真菌的检验，也是制备其他培养基的基础成分。,2.营
9、养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖。 如：血琼脂平板、巧克力色平板等,3.鉴别培养基 利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的底物和指示剂，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。 如：单糖发酵管、伊红-美蓝琼脂培养基、克氏双糖铁琼脂等。,4.选择培养基 在培养基中加入抑制剂，抑制标本中的杂菌生长，利于所需细菌的生长。 如： SS琼脂 麦康凯培养基,5.特殊培养基 ：括厌氧培养基和细菌 L型培养基。,庖肉基,按物理性状分为,固体培养基,半固体培养基,液体培养基, 制作过程： 称量溶化调pH 过
10、滤分装加塞包扎灭菌无菌检查,细菌的分离培养和鉴定,1平板划线分离法 2斜面接种法 3液体接种法,（一）细菌的分离,4穿刺接种法 5倾注平板法 6涂布接种法,培养方法： 需氧培养法： 将已接种细菌的液体、半固体、固体培养基置37孵育1824h观察生长现象。,普 通 孵 箱, 二氧化碳培养法,包括 1、二氧化碳孵箱 （能自动调节二氧化碳 的含量和温度）,二氧化碳培养箱,2、烛缸法: 3、化学法： 按每升容积重碳酸钠0.4g与1mol/L盐酸0.35ml比例放入标本缸,密封后倾斜容器使两者接触产生CO2,烛缸二氧化碳培养法,厌氧培养法：厌氧罐培育法和厌氧袋法 1、厌氧罐培育法：用理化方法除去密闭容器
11、中的氧，造成无氧环境，以利于专性厌氧菌生长。 常用的有抽气换气法和气体发生袋法，以及需氧菌共生法、平皿焦性没食子酸法和庖肉基培养法,例：抽气换气法：,将已接种的平板放入真空干燥缸或厌氧罐中，放入催化剂钯粒和指示剂美蓝，先用真空泵抽成负压99.99kPa，再充入无氧氮气，反复三次，最后充入80%N2、10%H2、10%CO2的混合气体，如罐内无氧，则指示剂美蓝变为无色美白。 每次观察标本应重新抽气换气,厌 氧 罐,厌 氧 袋,厌氧盒,厌氧手套箱,第四节 细菌代谢及代谢产物,（一）碳水化合物的代谢 1. 糖发酵试验（单糖发酵试验）,糖,细菌,甲酸 + 溴甲酚紫,变黄,细菌,分解,甲酸,CO2和H2
12、,结果表示: 不分解- 、产酸+、产酸产气 +,甲基红试验（methy red，M）,葡萄糖,细菌,丙酮酸,产气杆菌,乙酰甲基甲醇,大肠杆菌,其他酸类,PH4.5+甲基红试剂,红色,主要用于大肠杆菌（+）和产气肠杆菌（）的鉴别,V-P（voges-proskauer）试验,两分子丙酮酸,脱羧缩合,乙酰甲基甲醇,KOH,二乙酰,胍基化合物,葡萄糖,红色化合物,细菌,常与甲基红试验一同使用，结果相反,葡萄糖氧化-发酵(O/F)试验,原理:细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。 氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。 细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧酵解的，称为发酵型。发酵
13、型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。 不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 利用此试验可以区分细菌的代谢类型。,方法：将待检菌同时穿刺接种于两支Hugh-Leifson培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35培养48h或更长。,结果：两支培养基菌无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵菌型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,-半乳糖苷酶（ONPG）试验,某些细菌具有-半乳糖苷酶,分解,邻-硝基酚- -D半乳
14、糖苷,黄色邻-硝基酚,迅速及迟缓发酵乳糖的细菌ONPG试验阳性 不发酵乳糖的细菌ONPG试验阴性,七叶苷试验,原理：胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌和D群链球菌都能在含有胆盐的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe2+反应形成黑色沉淀，使培养基变黑色。,七叶苷（含胆盐的培养基）,肠球菌 D群链球菌,七叶素,+,枸橼酸铁,黑色沉淀,方法：将被检菌接种胆汁-七叶苷琼脂培养基，35孵育1824h。 结果判断、解释和报告：细菌生长，且培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。 此试验是鉴定肠球菌的重要试验，但
15、不能区分D群中的肠球菌与非肠球菌。,吲哚试验（indol，I）,色氨酸,具有色氨酸酶的细菌 分解,吲哚 (靛基质),对二甲基氨基苯甲醛 (吲哚试剂),红色玫瑰吲哚,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别,（二）蛋白质和氨基酸的代谢,硫化氢试验,含硫氨基酸,细菌 分解,硫化氢无色气体,Fe2+/Pb2+,黑色硫化铅或硫化亚铁,主要用于肠杆菌科细菌中属及种的鉴别,明胶液化试验,明胶,胞外酶,分解,氨基酸,失去凝固力,液态明胶,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别 也用于鉴别炭疽杆菌（+）和类炭疽杆菌,苯丙氨酸脱氨酶试验,苯丙氨酸,苯丙氨酸脱氨酶,脱氨基,苯丙酮酸,+,氯化铁,绿色,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别,氨基酸脱羧酶试验,氨基酸,氨基酸脱羧酶,脱羧,胺+CO2,溴甲酚紫,紫色,伤寒沙门菌（伤寒、鸡沙门菌除外） （+） 志贺菌属（宋内和鲍氏除外）（）,尿素酶试验,尿素,含尿素酶的细菌,氨+酚红,红色,枸橼酸盐利用试验 （citrate utilization，C）,枸橼酸盐,细菌分解,碳酸盐,铵盐,氨(培养基变为碱性),使溴麝香草酚蓝 由绿色变为深蓝,用于肠杆菌科中属间鉴别,（三）碳源和氮源利用实验,IMViC试验:吲哚(I).甲基红(M).枸(C),结果:,大肠杆菌 + + - - (左图),产气杆菌 - - + + (右图),第五节 细菌感染的血清学检测,一、凝集反应： 1、玻片凝集法： 原理：用
