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1、1,1,第六章,微生物的生长及其控制 Growth and Control of Microorganisms,2,2,主要内容,测定微生物生长繁殖的方法 微生物的生长规律 影响微生物生长的主要因素 有害微生物的控制,3,3,概述,细胞生长 营养物质（环境中） 营养物质（原料、胞内） 合成细胞成分 细胞有规律增长 菌体增重 繁殖：菌体重量增加到一定程度，细胞开始分裂进入分裂阶段。 生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。 个体生长 个体繁殖 群体繁殖 群体繁殖 = 个体生长 + 个体繁殖,新陈代谢,跨膜,4,4,第一节 测定生长繁殖的方法,微生物纯培养分离 测生长量 计繁殖数,5,5,一、纯培养的
2、方法,纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养. 液体稀释法 平板划线分离法（Streak Plate） 倾注平板法（Pour Plate） 平板涂布分离法（Spread Plate） 选择性培养分离法 单细胞（单孢子）分离法 膜过滤法,6,6,液体稀释法适合于细胞较大的微生物,将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.,7,7,平板浇注与涂布法,8,8,平板划线分
3、离法,9,9,选择培养基分离法,1.dilute sample,1 ml,9 ml,10 100 1000 104 105 106 107,10,10,二、测生长量 （细胞量）,适合于所有的微生物 直接法 测体积 称干重 （1012细菌细胞约1g，只适合菌体浓度较高且不含 杂质的样品） 菌体内重要组成测定法,含N量法,DNA/RNA法,叶绿素法,11,11,间接法 比浊法 用光密度（OD450-650nm ）表示菌悬液的浓度 测含氮量 生理指标法 测含碳量 其它,12,12,三、测繁殖数（细胞数）适合于单细胞微生物,直接法 比例计数法 血球计数板法 （全菌计数法）既包括活菌又包括死菌 间接法
4、液体稀释法 （MPN法） 平板菌落计数法 （涂布法、浇注法）活菌计数法 滤膜培养法,各种型号的全自动血球计数仪,13,13,血球计数板计数网的分区和分格,14,14,活菌技术的一般步骤,15,15,第二节 单细胞微生物的生长规律,细菌的个体生长和同步生长 单细胞微生物的典型生长曲线 微生物的连续培养,16,16,同步生长：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态。进行同步分裂的细胞称为同步细胞。 意义：同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,一、同步生长 （synchronous growth）,时
5、间,同步生长和非同步生长,17,17,同步培养的方法,1. 选择法 离心沉降分离法： 过滤分离法： 硝酸纤维素薄膜法： 2.诱导法 温度调整法 营养条件调整法 用最稳定期的培养物接种,由于细胞个体间存在着差异，同步生长只能维持1至2代，不能长久维持。,18,18,19,19,二、微生物的群体生长的规律,单细胞微生物的群体生长特征 单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌， 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的,20,20,单细胞微生物典型的生长曲线,研究细菌群体生长的规律是采用分批培养的方式进行的，即在一定体积的液体培养基中接种少量的细菌进行培养，定时取样测定菌体含量，可以得到一条有规律的曲线微
6、生物的典型生长曲线,21,21,单细胞微生物的生长特征,细菌是以二分裂的方式进行繁殖的，每分裂一次，为一个世代。每经过一个世代，群体数目增加一倍。这种类型的群体生长为指数生长。,22,22,这种指数增长可以用以下的方程式表示： X2=X12n 式中： X2 和X1为时间t2和t1时的细胞数，n为世代数 lgx2=lgx1+nlg2 R为生长速度，即单位时间内的世代数 设G为世代时间（代时），即分裂一次所需的时间。即G为R的倒数,23,23,1.延滞期(lag phase),（缓慢期、停滞期、调整期、适应期） 现象： 出现延滞期的原因 生理特性 影响延滞期长短的因素,24,24,出现延滞期的原因
7、,把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程 。,现象： 活菌数没增加，曲线平行于横轴,25,25,生理特性,分裂迟缓，代谢活跃 生长速率常数等于零R=0，开始细胞数目几乎保持不变，甚至稍有减少。 菌体内物质的重量明显增加，菌体体积增大，杆菌明显升长。 含量增加 代谢机能非常活跃，易产生大量的诱导酶 延滞期末期和对数期前期的细胞，对不良条件的抵抗力减低。,26,26,影响延滞期长短的因素,菌种本身 细菌、酵母菌的延滞期较短 霉菌次之 放线菌最长 接种龄 种子的年龄 接种量： 发酵工业上一般采用1/1
8、0的接种量 培养基成分,27,27,缩短延滞期的意义和方法,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期 接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄 加大接种量 用与培养菌种相同组成分的培养基 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,28,28,2.指数期(exponential phase) （对数期）,现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 生理特性： R最大，G（代时）最短 细胞代谢活动比较稳定，菌体内各种成分最均匀，生理特性较一致。 酶活力最高，酶系活跃，代谢旺盛 活菌数几乎接近于总菌数 指数期细胞高速生长的原因：养分、生长空间丰裕，且代谢产物还不足以影响生长。,指数期的
9、细胞是进行生理、代谢、遗传等研究的最好材料。,29,29,影响指数期长短的因素：,菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,30,30,营养物浓度与对数期生长速率和产量的影响,作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量 生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物,31,31,3.稳定期(stationary phase) （平衡期）,生理特性： R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等（动态平衡） 细胞质内开始积累细胞贮存物。如糖原、脂肪、聚羟丁酸和多聚偏磷酸盐。多数产芽孢的菌在此产生芽孢。 稳定期的长短因菌种和培养条件而异，若生产需要，可在菌种或工艺上采取措施（如补料
10、、调pH、调整温度）设法延长稳定期，以积累更多的代谢产物。 如果要收获菌体（如 scp），应在此阶段收获，因此阶段菌体细胞数量最多。 放线菌的的抗生素在此阶段大量形成。,32,32,出现稳定期的原因：,营养的消耗 营养物比例失调 有害代谢产物积累 pH值EH值等理化条件不适,33,33,应用意义：,发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,34,34,生长产量常数（Y，或生长得率，growth yield）,概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重/ 消耗营养物质
11、的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量 如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。,35,35,4.衰亡期(decline phase/death phase),生理特征： R0，个体死亡的速度超过新生的速度，活菌数明显下降。 因细胞本身所产生的酶和代谢产物的作用，而使菌体分解死亡 ，有的开始自溶。 有些微生物产生或释放对人类有用的抗生素，氨基酸等次级代谢产物。芽孢开始释放。 低温、隔绝空气（对好氧菌）均能延长此时期。 细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型 G+ G-,36,36,丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培
12、养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。 以菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。 可分为三个阶段： 生长停滞期 迅速生长期 衰退期,丝状真菌的生长曲线 1.对应线性纵坐标（左） 2.对应对数纵坐标（右）,37,37,丝状微生物的生长曲线,生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。 迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物
13、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,38,38,三、连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的培养基中，经培养生长，最后一次收获的培养方式。 连续培养（continuous culture） ：在培养容器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样的速度排出菌体以及代谢物的培养方式。让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,39,39,单批培养与连续培养的关系,40,40,连续培养的优点和缺点,优点 高效（简化了装料、灭菌、出料和发酵罐清洗）、自控程度高（可利用传感器和仪表进行自动控制）、产品质量稳定、节约动力、人力、水和蒸汽 缺点 菌种退化（菌种自发突变）、易污染（设备渗漏、通气过滤失灵）、对营养物利用率低 连续培养的应用：连续发酵 酵母菌体的生产：单细胞蛋白SCP 乙醇、乳酸、丙酮、丁醇生产 石油脱蜡（解脂假丝酵母）、污水处理,41,41,连续培养的分类,按控制方式 恒浊器（控制菌体密度
