微生物的生态与环境保护

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1、前言 第一节 微生物在自然界中的分布 第二节 微生物与环境间的关系 第三节 微生物与自然物质循环 第四节 微生物与环境保护,第八章 微生物的生态与环境保护,前 言,一、生态学 生态学是一门研究生命系统与环境系统间相互作用规律的科学 二、微生物生态学 微生物生态学是生态学的一个分支，它的研究对象是微生物群体与其周围生物和非生物环境条件间相互作用的规律。,三、生态学研究范围：生物圈(biosphere)、生态系统(ecosystem)、群落(community)、种群(population)。 四、研究意义： 理论：地球进化和生物进化原因 实践：开发菌种资源、防治有害微生物、新的微生物农药、菌肥、

2、医药、混菌发酵、生态农业，促进探矿、冶金、环保、提高土壤肥力以及开发生物能等,几个概念,生物圈：地球上的所有生物。 生态系统：生物群落与其无机环境相结合、相作用、相调控而成的动态系统。 群落：同一环境中两个以上种群由于生活繁殖上的连锁而构成相依赖、相制约的生物集团。 种群：生活在同一环境中的同种个体组成的能繁殖集团。与同种别地的种群有隔离、有界限。,第一节 微生物在自然界中的分布,一、土壤中的微生物 土壤是微生物生活的良好环境 （1）土壤的矿物质成分，提供微生物需要的矿质养料； （2）土壤中的动植物残体，以及耕作土壤中有机肥料， 源源不断地供给微生物碳素养料和氮素养料； （3）土壤的持水性为微

3、生物提供水分条件； （4）土壤的孔隙性和土壤水分多少，直接影响土壤的通 气条件。 （5）土壤的pH范围在3.510.5之间，多数在5.58.5之 间，这是大多数微生物活动最适宜的pH； （6）土壤的保温性，比地面空气温度变化小，也为微生 物的生长提供了良好的条件。,同一土体由于微环境的通气、水分、营养等状况都存在着差异，致使不同微生物呈立体分布。 每克肥土中通常含有几亿至几十亿个微生物，贫瘠土壤每克也有几百万至几千万个微生物。 （1）细菌数量：7090%；种类：主要为腐生，少数自养 分布：表层最多，随土层加深减少，厌氧菌反之。 （2）放线菌数量：530% （3）真菌 （4）藻类 （5）原生动物

4、, 土壤中微生物的分布,农田土壤上层15cm处微生物数量和生物量,1、取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2-10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取10-15g，称重后经105烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。,土壤微生物的分离和计数,2、倒平板 熔化已灭菌的四种培养基(细菌、霉菌、酵母菌、放线菌四大类 )并冷却至45左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。,3、编号 取5支无菌空试管（15150mm）依次编号为10-3

5、、10-4、10-5、10-6、10-7。 4、分装无菌水 按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。,5. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10-20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，整个稀释过程如图。,6、混菌法接种 细菌分离分别精确吸取10-7，10-6，10-5三个稀释度的菌液1mL；放线菌分离分

6、别吸取10-5，10-4，10-3三个稀释度的菌液1mL；霉菌分离分别吸取10-4，10-3，10-2三个稀释度的菌液1mL；酵母菌分离分别吸取10-6，10-5，10-4三个稀释度的菌液1mL，对号加在已凝固的平板上，同时做空白对照，空白对照只加培养基，不接种菌液。 7. 培养 将涂布后的平板上倒置于恒温箱中，细菌在37下培养24-48h，霉菌在28下培养3-5d，放线菌在28下培养5-7d，酵母菌30下培养2-3d,观察结果。,二、微生物在水中的分布 水体中微生物的来源 土壤、空气、动植物尸体、人和动物的排泻物、工业及生活污水。 种类 水中存在的微生物90%为革兰氏阴性菌，主要有弧菌、假单

7、胞菌、黄杆菌等。鞘细菌及有柄附生细菌也常见于水体中。 微生物在水体中的分布 水域中微生物的种类和数量与水域的有机物、无机物的种类和含量，光照、酸碱度、渗透压、温度、含氧量和有毒物质的含量有密切关系。, 各种水系,清水型水生微生物,洁净湖泊和水库，微生物数量少（10-103/ml），以化能自养型和光能自养型微生物为主，部分腐生细菌，如色杆菌和微球菌等；霉菌中如水霉、绵霉等的一些种；以及单细胞和丝状藻类、原生动物，数量较少。 根据微生物对水生环境中的营养要求，将其分为三类：贫营养细菌（1-15mgC/L）、兼性贫营养细菌（指一些在富营养培养基中经反复培养后也能适应并生长的贫营养细菌）、富营养细菌（

8、10gC/L） 贫营养指数（O.I）：某水样中贫营养细菌占总菌数的百分比,环境：大量的人畜排泄物、生活污物和工业废水等，有 机物含量大增 微生物数量和类群： 数量：大量外来的腐生细菌，使腐败型水生微生物尤其是细菌和原生动物大量繁殖，每毫升达到107-108个。 类群：G-无芽孢杆菌，如E. coli, Bacillus、Vibrio和Spirillum等的一些种,纤毛虫类、鞭毛虫类和根足虫类等原生动物,动植物致病菌。 繁殖及后果：因水环境中的营养等条件不能满足其生长繁殖的要求，加上周围其它微生物的竞争和拮抗关系，一般难以长期生存，但水体的流动，会造成病原菌的传播。,腐败型水生微生物,海水型水生

9、微生物,平均含盐量：3.5%，密度大、渗透压高、冰点低 微生物组成：藻类、芽孢杆菌、假单孢菌、弧菌、发 光细菌等 生 理：兼性厌氧，生长慢，能在低营养下生活，常 产色素，分解蛋白质能力强，解糖能力低， 多嗜冷，对热敏感； 分 布： 透光区：多种海洋微生物 无光区：一些微生物 深海区：少量微生物 超深渊海区：极少时耐压菌, 水的净化作用,水体自净作用 各种生物学和物化作用，表现在好氧菌对有机物的分解作用、原生动物对细菌等的吞噬作用，噬菌体对宿主的裂解作用，以及微生物产生的凝胶物质对污染物的吸附、沉降作用等使水中有机物含量降低。 水体的人工净化 1）机械净水法(过滤法)：是通过厚的沙层机械地将细菌

10、滤掉， 繁殖于沙层上的原生动物会吃去部分细菌而使菌数大减； 2）化学净水法：为杀死水中的病原菌而使用杀菌剂对水进行处 理的方法； 3）物理净水法： 采用紫外线、臭氧、煮沸等对水进行净化处理的方法。, 饮用水的微生物学标准,大肠菌群与饮水标准 大肠菌群指的是需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 水中的微生物种类，一般用大肠菌群数作为是否含有病原菌的指标。我国的饮水标准是：自来水中细菌总数应在100个/ml以下(37，24h)，而1000ml自来水中的大肠菌群数不能超过3个(37，48h) 。 饮用水的检测方法 1）细菌总数是指1ml水样在普通琼脂培养基中37经24h培

11、 养后，所生长的菌落数。细菌数越多，有机物含量越高 作用：判定食品被细菌污染的程度及卫生质量的优劣，对被 检样品做出适当的卫生学评价。 步骤：样品的稀释倾注平皿培养48小时计数报告。, 样品的处理和稀释,环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。, 稀释样品的取样和倾注平皿,培养及计数,培养条件：倒置于361温箱内培养482h; 计数时间：到达规定培养时

12、间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h; 计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数; 规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。,注意： 当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间 无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条 不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把 链上生长的每一个菌落分开计数。 如有片状菌落生长，该平板

13、一般不宜采用，如片状菌落 不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板 的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘 以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,计数原则：选平均菌落数在30300之间者进行计算,仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数 乘其稀释倍数报告之。 若有2个稀释度的平均菌落数在30300之间时，则按两者的 菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均 数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平 均菌落数乘以稀释倍

14、数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以 最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最 大稀释倍数。 在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大 片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生 长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约 为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则 可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板 的菌落数。,报告原则,菌落总数报告方式,菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时

15、，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。 固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。, 检验查表方法,2）大肠菌群数的测定国家标准采用三步法 用滤膜培养法在选择性和鉴别性培养基（EMB培养基）上进行，在EMB培养基上呈现紫色且有绿色金属闪光 的菌落。(MPN表: Most Probable Number ),较清洁样品的三步法图示多管发酵法,三步法图示,大肠菌群测定,计算方法,产酸判断：紫色培养液变成黄色; 产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试

16、管 有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产 生，需进一步试验; 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落； 红色、粉红色菌落; 抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。,美国FDA(Food and Drug Administration)标准方法 行业标准采用两步法,用于对出口食品中大肠菌群进行检验,LST肉汤:月桂基硫酸盐胰蛋白, 微生物在空气中的分布,生态学特征：营养物质缺乏、紫外线照射、干燥； 大气中的微生物 球菌、芽孢杆菌、产色素细菌以及对干燥和射线有抵抗力的真菌孢子等。 大气中微生物的测定方法 (1)培养皿沉降法 将含有琼脂培养基的平皿盖打开，使之暴露于空气中一定时间，以待微生物沉降于培养基表面，培养成菌落后，即可统计。 (2)液体阻留法 将一定容积的空气样品，以很细小的气泡通过液体介质，使微生物分散在介质中，然后取一定量的含菌液涂布在平皿上，经培养后测定样品中的微生物含量。,