基因的克隆与表达

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1、分子生物学综合性实验分子生物学综合性实验 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因 克隆 表达 纯化 吴海珍 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因 克隆 表达 纯化 吴海珍 等等 华华 东东 理理 工工 大大 学学 应用生物学系应用生物学系 二五年一月二五年一月 第一部分第一部分 碱性磷酸单酯酶基因的碱性磷酸单酯酶基因的 定位、克隆与表达定位、克隆与表达 实实 验验 流流 程程 图图 碱性磷酸单脂酶基因在染色体 DNA 上的杂交定位Southern Blotting 碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增PCR 扩增 PCR 体外扩增片段的克隆连接于 T-载体连接 连接产物转化大肠杆菌受体菌转化 转化子质粒 DNA 的抽提快速

2、法制备质粒 转化子的鉴定限制性内切酶酶切 目的转化子 DNA 的大量制备碱法抽提质粒 DNA 酶切回收克隆的目的基因片段回收目的基因 重组表达型质粒的构建连接、转化、鉴定 重组大肠杆菌目的蛋白的表达蛋白电泳 实实 验验 路路 线线 E. coli Chromosomal DNA E. coli Chromosomal DNA A A pMD18-T 杂交定位 phoA PCR扩增 1.5 kb T T 连接 转化 划线扩增 转化子 快抽质粒 酶切鉴定 KpnI BamHI SacI EcoRI XbaI HindIII SphI AccI PstI SalI 4.1kb pMD-phoA re

3、p lacZ phoA Apr NdeI 0 NdeI EcoRI 1197 SphI1415 BamHI 1550 KpnI BamHI SacI EcoRI XbaI HindIII SphI AccI PstI SalI 4.1kb pMD-phoA rep lacZ phoA Apr NdeI 0 NdeI EcoRI 1197 SphI1415 BamHI 1550 EcoRI 0.4+3.7kb 1.4+2.7kb SphI 1.2+2.9kb 0.2+3.9kb (1) (2) (1)(2) NdeI/BamHI BamHI NdeI 1.5 kb 电泳回收 pET-11a 5.

4、6 kb T7 ori lacI BamHI Nde I SphI Pst I HindIII Apr XbaI 连接、转化、扩增和鉴定 pET-11a:phoA 7.1kb 重组菌发酵、表达产物纯化与测活 目的蛋白 1 DNA 的酶切的酶切 摘要摘要 本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种 酶联合酶切的常用策略等。 1.1 实验原理实验原理 DNA 重组技术中的第一步是从不同来源的 DNA（染色体 DNA 或质粒 DNA）上将待克 隆的 DNA 片段特异性切下，同时在载体 DNA 分子（一般为质粒 DNA）上打开相对应的缺 口，然后将两者连接成重组 DNA

5、分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切 酶来完成。 限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链 DNA 分子的断裂， 产生相应的限制性片段。 早在 20 世纪 50 年代初微生物体内的限制核修饰作用 就已发现，10 年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。以大肠杆菌为例，在 K 株和 B 株中都含有各自不同的限制修饰系统，两种不同来源的噬菌体（K和B）长期寄 生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体 DNA 和噬菌体 DNA 特异性 的保护， 封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点， 故它们在感染相应的宿主细胞 （K 株和 B 株）

6、时 DNA 不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时， 由于没有特异性的保护作用，入侵的 DNA 分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而 感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。这一现象普遍存在与原核细菌中。但由于宿 主细胞内的降解作用的不完全，入侵的 DNA 分子总有极少数能完整保留下来并得以在细胞 体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。这修饰过的 DNA 分子再重新 制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制修饰作用被解除。 1.1.1 限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类 目前在细菌中发现有 600 多种限制性核酸内切酶，

7、根据其性质不同可分为三大类 （见表 1-1） 。其中 II 类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且 由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于 DNA 的重组实验。I 类和 III 类酶严格 地说应该称为限制修饰酶， 因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的 功能单位，包含在同一酶分子中。 表表 1-1 各类限制性内切酶的特性各类限制性内切酶的特性 I 类酶 II 类酶 III 类酶 酶分子 三亚基双功能酶 内切酶和甲基化酶分开 二亚基双功能酶 识别位点 二分非对称序列 46bp 短序列， 大多数为回文结构 57bp 非对称序列 切割位点 距离识别

8、位点至少 1 000bp，无特异性 在识别位点中 或靠近识别位点 在识别位点下游 2426bp 处 限制性反应与甲基化反 应 互斥 分开的反应 同时竞争 限制作用所需的辅因子 ATP、Mg2+、 S-腺苷甲硫氨酸 Mg2+ ATP、Mg2+、S-腺苷 甲硫氨酸（非必需） DNA 重组中的用途 无 有 无 1.1.2 II 类限制性核酸内切酶的基本特性类限制性核酸内切酶的基本特性 II 类限制性核酸内切酶是 Smith 等人于 1968 年在流感嗜血杆菌 d 型菌株中发现的。该 类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双 DNA 的识别与切割活性仅需要 Mg2+，且识别与 切割位点的序列大都具有严格的

9、特异性，因而在 DNA 重组实验中广泛使用。 目前已分离出 400 余种 II 类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有 300 多种， 商品化的酶 NEB（New England Biolabs）公司品种最多，达 220 余种，其中在 DNA 重组实 验中常用的有 20 多种。这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成（见图 1-1） 生物体属名的第一个大写字母 生物体种名的前两个小写字母 生物体菌株株名或质粒名（非必需） 生物体中发现限制性酶的次序 1 2 3 4 5 HindIII: Haemophilius influenzae d 中发现的第三个限制性内切酶酶 EcoRI: Es

10、cherichia coli中发现的第一个限制性内切酶酶，编码基因在抗药性质粒R上 SacI: Streptomyces achromogenes 中发现的第一个限制性内切酶酶 图图 1-1 限制性内切酶的命名原则与示例限制性内切酶的命名原则与示例 1.1.2.1 识别位点识别位点 II 类限制性内切酶的识别位点具有 180旋转对称的回文结构，常用的识别序列往往为 6 个碱基对，例如 HindIII 的识别序列： 5 - A A G C T T - 3 3 - T T C G A A - 5 其中一部分的识别序列某一或某两位碱基并非严格专一， 但都在两种碱基中具有可替代 性，这种不专一性并不影

11、响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了 DNA 分子上的酶识 别与作用频率，例如 AvaI 的识别序列就是典型的结构： 5 - C C C G G G - 3 3 - G G G C C C - 5 T AT A 有的酶识别位点为 4 或 5 碱基对，如 AluI、HaeIII 和 Sau3AI（见图 1-2）等，在 DNA 上的出现频率则较高，而象 Sau3AI 切割 DNA 后产生的是粘性末端，且与 BamHI 切割后的 粘性末端相同，为大规模克隆提供了可能。实际应用中利用 Sau3AI 高频现象，结合 DNA 的部分酶切策略进行研究也是常用的实验手段。 5- A G C T - 3 3

12、- T T C G - 5 5- G G C C - 3 3- C C G G - 5 5- G A T C - 3 3- C T A G - 5 AluIHaeIIISau3AI 图图 1-2 限制性内切酶的命名原则与示例限制性内切酶的命名原则与示例 另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在 DNA 链上出现频率也相对较低，如 FseI （5-GGCCGGCC-3） ，出现频率为 1/48 = 1/65kb。实际上由于不同生物体的 DNA 碱基含量 不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。大肠杆菌基因组中 AT 含量较丰富，所以富含 AT 的识别序列（如 DraI：5-TTTAAA-3；PshB

13、I：5-ATTATT-3；SspI：5-AATTAA-3） 较为频繁的出现， 而链霉菌基因组因 GC 含量高， 相应的富含 GC 碱基对的识别序列 （NaeI： 5-GCCGGC-3；SmaI：5-CCCGGG-3；SacII：5-CCGCGG-3）较常见。 1.1.2.2 粘性末端粘性末端 限制性内切酶切割 DNA 产生的末端根据被切开的 DNA 末端性质的不同（不考虑碱基 序列）可分两大类：平端和粘端，而后者又可分为 3-OH 突出或 5-P 突出两种，分布情况 见图 1-3，故 DNA 分子的连接通常发生在同种限制性内切酶酶切后的 DNA 间。 （3）3粘性末端 PstI （2）5粘性末

14、端 HindIII （1）平头末端 EcoRV 5- GATATC- 3 3- CTATAG- 5 5- GAT 3- CTA ATC- 3 TAG- 5 + 5- AAGCTT- 3 3- TTCGAA- 5 5- A 3- TTCGA P 5 OH 3 AGCTT- 3 G- 5 5P 3OH 5- CTGCAG- 3 3- GACGTC- 5 5- CTGCA 3- G P 5 OH 3 G- 3 ACGTC- 5 5P 3OH + + 图图 1-3 DNA 酶切产生的三种末端酶切产生的三种末端 实际上 DNA 重组应用中，由于不同限内酶酶切能产生相同粘性末端，因此 DNA 分子 的连接

15、可发生在不同限内酶之间，常见的 DNA 分子连接情况见图 1-4。而在重组工作中如 没有合适的酶切口产生相同的粘性末端， 则可对酶切后的突出粘性末端进行补平， 采用平头 连接策略。 （1）同种酶产生的粘性末端 5- G 3- CCTAG GATCC- 3 G- 5 + 5- GGATCC- 3 3- CCTAGG- 5 （2）不同种酶产生的相同粘性末端 BamHI: 5-GGATCC-3 5- 3- CTAG GATCC- 3 G- 5 + 5- GATCC- 3 3- CTAGG- 5 a：保留一种酶切位点 Sau3AI: 5-GATC-3和BamHI: 5-GGATCC-3 b：原酶切位点消失 5-G 3-CAGCT TCGAG- 3 C- 5 + 5- GTCGAG- 3 3- CAGCTC- 5 SalI: 5-GTCGAC-3和XhoI: 5-CTCGAG-3 图图 1-4 DNA 粘性末端的连接效果粘性末端的连接效果 1.1.2.3 甲基化影响甲基化影响 大多数大肠杆菌菌株中含有 Dam 甲基化酶和 Dcm 甲基化酶， 前者可以在 GATC 序列中 腺嘌呤 N-6 位上引入甲基，后者在 CCA/TGC 序列的第一个胞嘧啶 C-5 位置上引入甲基。部 分限制性内切酶对甲基化