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1、第二章 发酵工业菌种,发酵工业菌种概述,发酵工业菌种的分离筛选,发酵工业菌种的鉴定,发酵工业菌种的改良,发酵工业菌种的保藏,一 发酵工业菌种概述,细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 未培养微生物,细菌,细菌：单细胞的原核生物,杆菌 球菌 螺旋菌,基本结构： 特殊结构：,主要为横分裂,大小、形状、边缘、表面、隆起度、光泽、颜色、透明度等,形 态,结 构,繁殖方式,菌落特征,细胞壁：坚韧而有弹性赋予菌体一定的形状，和保护菌体的作用，有许多小孔，供物质通过，鞭毛运动的支点,细胞膜：柔软而有弹性，控制内外物质的交换，细胞 必须与周围环境发生信息、物质与能量的交换，才能完成特定的生理功能。,细胞质：无色透明的胶
2、状物，是细菌的内环境，含有很多酶，是合成蛋白质和RNA的场所，也是营养物质合成、转化以及代谢的场所,细胞核：原核，无核膜和核仁，是双链环状DNA，控制细菌的繁殖、遗传和变异,结构特点 单细胞非丝状，个体很小 原核结构 细胞壁含特殊的肽聚糖（与抗生素的功能有关） 有些细菌有特殊结构,菌 落,将分散的细胞或孢子接种到固体培养基上，如果条件适宜，便会迅速生长繁殖，由于细胞受到培养基表面或深层的限制，繁殖的菌体常以母细胞为核心聚集在一起，形成一个肉眼可见的具有一定形态结构的子细胞群体，是鉴别细菌的重要依据,菌落,菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。,细菌菌落特征剖面图,细菌菌落特征正面图,菌
3、落,芽孢：某些细菌在一定生理时期，在细胞内形成的可抗不良环境的休眠体。成熟后游离出来，条件适宜时形成新的个体。,荚膜：某些细菌分泌到胞外的黏液性物质。主要成分为：水、多糖、有些含少量多肽和蛋白质，赋予细胞抗干燥和抗吞噬能力,鞭毛：一些杆菌，螺旋菌和少量球菌从体内长出的纤细的呈波状的丝状物，起于细胞膜上的鞭毛基粒，穿过细胞壁，伸至菌体的外面，是细菌的运动器官，鉴别细菌的依据,存在,作用,放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物,有机物,丰富的微碱,性土壤中，多腐生,多种抗生素,放 线 菌,生产,形态结构,单细胞，分枝发达的菌丝组成，G+少数G-。结构与细菌基本相同。菌丝分营养
4、菌丝、气生菌丝和孢子丝。,繁殖方式,主要通过形成无性孢子的方式繁殖，孢子具有较强的耐干燥能力,菌落特征,由菌丝体组成。一般圆形，光平或多皱折；光学显微镜下菌落周围有辐射状菌丝，可在瓶壁、液面形成斑状或膜状菌落，或沉到培养基底部。,营养菌丝 生长于培养基内，具有吸收营养的功能 气生菌丝 （长在空气中）营养菌丝长到一定程度长出培养基 孢子丝（繁殖菌丝） 气生菌丝发育到一定程度，上端分化成产生孢子的菌丝,酵母菌,形态结构,单细胞真核生物，无鞭毛，有一定形态大小，随菌龄和环境条件的变化而异，一般为圆形、椭圆形、卵圆形、柠檬形等，有的可形成假菌丝,繁殖方式,无性繁殖：芽殖、裂殖 有性繁殖：子囊孢子,菌落
5、特征,与细菌相似，比之大而厚。菌落表面光滑，湿润，粘稠，大部分为乳白色，少数呈现红色或黄色。,形态结构,繁殖方式,霉 菌,由分枝或不分枝的菌丝构成，菌丝交织形成菌丝体。 细胞结构有明显的分化 菌落呈大小和颜色等特征，不同菌种差别很大，蜘蛛网状，棉絮状和丝绒状,繁殖能力很强，产生有性和无性孢子进行繁殖，菌丝片段亦可繁殖,发酵工业所需菌种,细菌类如短杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、棒杆菌、梭状芽孢杆菌等； 酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、汉逊酵母和假丝酵母等； 霉菌如黄曲霉、红曲霉、青霉菌和赤霉菌等； 放线菌如各种抗生素，链霉素、庆大霉素等。,未培养微生物,概念 未培养微生物：采用现
6、有的微生物纯培养分离和培养方法还没有获得纯培养的微生物 极端微生物：在极端环境下能够生长的微生物 研究方法 模拟自然培养法和宏基因组分析法,模拟微生物生长的自然环境进行可培养研究。集中在原位培养，培养条件优化和单细胞操作等方面,模拟自然培养法,依据基因或基因组、蛋白质序列及其调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。,宏基因组分析法,原位培养是一种模拟生境技术，一般使用瓶、实验桶、透析袋或微孔滤膜组成围隔，将要研究的样品放入原来位置进行培养。 生境又称栖息地。具有一定环境特征的生物生活或居住地。延龄草的生境是落叶林内的阴湿处。生境也可为整个群落占据的地方，沼泽群落的生境是在世界各地潮
7、湿的沼泽中。生境是由生物和非生物因子综合形成的，而描述一个生物群落的生境时通常只包括非生物的环境。,二 发酵工业菌种的分离筛选,概 念,方法设计依据,注意,将混杂有各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取快速，准确有效的 方法进行分离和筛选， 从而得到所需微生物 的过程。,生产的实际需要 目的代谢产物的性质 产生目的产物的微生物种类 微生物的分布、特性和生活环境,方法的选择性和灵敏度,发酵工业对菌种的要求,在廉价原料制成培养基上生长，目的产物产量高，易回收 生长速度快，发酵期短 培养条件易控制 抗噬菌体和杂菌污染能力强,稳定的遗传学特性：菌种质量稳定，不易变异退化 对放大设备的适应性强 菌
8、种不是病原菌，无有害的生物活性物质和毒素产生,符 合 要 求 的 菌 种,从菌种保存机构直接购买,从自然界分离筛选,发酵水平的批号中重新分离筛选,菌种分离筛选步骤,采集样品,样品处理,富集培养,菌种初筛,菌种复筛,性能鉴定,菌种保藏,调查研究（包括资料查阅）,筛 选 工 作 程 序,样品采集原则,来源越广泛，得到新菌种可能性越大,目标产物的性质和产生目标产物的微生物性质以及生理特性,代谢规律,生理特性,有机质含量 通风状况,季节条件,地理条件,土壤酸碱度 植被情况,样品预处理,样品预处理,目的,方法,物理法,化学法,诱饵法,加热,离心法,膜过滤法,富集培养,使混合微生物群体中某特定微生物比例激
9、增的培养方法。 一可用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件；二可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。 用于增殖好氧性自生固氮菌的Ashby无氮培养基；增殖土壤真菌用的Martin培养基等。其三可用连续培养法，在一定稀释率下，使比生长速率小的细胞溢出培养器，而比生长速率大的细胞留在培养器中。,富集培养,富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验为例,目 的,方 法,分 类,原 理,分批培养 连续培养 半连续培养,控制培养基的营养成分 控制培养条件,不同种类微生物生长繁殖对环境和营养的要求不同，创造合适条件，使目的微生物 迅速生
10、长繁殖，成优势菌种,增加待分离微生物的数量，提高分离效率,富集培养,分 批 培 养,目的微生物的生长会使培养基的性质发生改变，最初的选择压力随之改变，其他微生物的生长得以恢复。富集培养物接种到新的同一种培养基上，继续富集培养。,比 生 长 速 率,单位菌体在单位时间内生长所增加的菌体量,连续培养,连续培养： 利用比生长速率进行富集。通过改变限制性基质的浓度，控制不同菌体的比生长速率 半连续培养：分批补料培养,菌种分离,目的,方法,把目的微生物从混合的多种微生物中分离出来,平板划线分离法 稀释分离法 简单平板分离法 涂布分离法 毛细管分离法 小滴分离法,稀释倒平板法：,无菌水、梯度稀释、50左右
11、的琼脂培养基、灭过菌的培养皿。注意要稀释得当。 分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。,涂布平板法,Spread plate,无菌水、梯度稀释 涂布平板,平板划线分离法,利用固体平板的生化反应进行分离 （方法之一）, 利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率,透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑菌圈法,1、透明圈法, 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；, 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生
12、透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。,土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。,例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌, 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈, 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的,2、变色圈法,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入
13、指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；,用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。,如 筛选果胶酶产生菌,甘油三丁酸酯为底物 罗丹明B为指示剂 荧光圈,又如 分离解脂微生物,豆油作底物 中性红（红黄. 6.88.0. ）指示 菌落周围呈红色圈,3、生长圈法, 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌,将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈, 工具菌
14、（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株,如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌,4、抑菌圈法, 常用于抗生素产生菌的分离筛选,据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。 抑菌圈法是常用的初筛方法, 工具菌采用抗生素的敏感菌,若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,菌种初筛和复筛,目的,方法,目的：筛选产物合成能力较高的菌株,产物可和指示剂、显色剂或底物等发生反应直接定性鉴定； 生产性能测定初筛和复筛,概念：把具
15、有目的产物合成能力的微生物从分离后的大量微生物中筛选出来。 方法：平板筛选；摇瓶发酵筛选,初 筛,概念：在初筛基础上进一步鉴定菌株生产能力的筛选 方法：摇瓶培养,复 筛,野生型菌株：直接从自然界的样品中分离得到的具有一定生产性能的菌株,内容：测定必要的鉴定指标 查权威鉴定手册，确定菌种类型,指标：形态、生理、生化以及遗传等指标,技术水平：细胞的形态和习性水平；细胞 组分水平；蛋白质水平；基因或核酸水平,菌种 鉴定,鉴定方法：经典分类鉴定方法；现代分类鉴定方法；权威鉴定机构鉴定,三 发酵工业菌种 鉴定,经典分类鉴定方法指标,形态学特征,生理生化特征,血清学实验与,噬菌体分型,氨基酸序列,与蛋白质分析,现代分类鉴定方法,微生物遗传型的鉴定,细胞化学成分特征分类法,数值分类法,DNA的碱基组成,核酸的分子杂交,遗传重组特性分析,rRNA序列分析,目的,目标,四 发 酵 工 业 菌 种 改 良,提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程,改变微生物的遗传结构，打破原来的代谢调节机制；根据需要，进行目的产物的过量生产,初级代谢：产生初级代谢产物的代谢体系或过程。分为分解代谢体系和合成代谢体系。,菌 种 代 谢 生 理
