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1、第十三章 微生物细胞工程,微生物细胞的特点,微生物作为可以独立存在的个体，其生长特点、代谢的特点与植物、动物有着显著的区别。 一般情况下，微生物由其自身完成其基本功能；,微生物菌种选育的目的和意义,微生物细胞的改造育种,传统菌种选育技术 杂交和原生质体融合技术 基因工程 定向进化,传统菌种选育技术,自发突变育种 诱变育种,微生物突变类型,遗传变异类型,自发突变育种,从生产中育种 定向培育优良菌株,诱变育种,诱变育种的基本环节,谷氨酸棒杆菌的野生型（左）和dapD突变株（右）细胞的电镜照片,诱变育种中的几个原则,挑选优良的出发菌株 单一遗传纯菌株 选用对诱变剂敏感的菌株 选用有应用前景的菌株 来
2、自生产中的自发突变菌株 选择简单有效的诱变剂及合适剂量 处理单细胞或单孢子悬液 复合诱变剂的处理,营养缺陷型的筛选方法,1、诱变处理 2、淘汰野生型 抗生素法 青霉素 制霉菌素(抑制甾醇的合成) 菌丝过滤法(适于真菌和放线菌) 3、检出缺陷型 4、鉴定缺陷型,检出缺陷型,基本培养基,基本培养基(含菌),基本培养基,完全或补充培养基,夹层培养法,限量补充法,1%蛋白胨,检出缺陷型,逐个检出法,完全培养基,基本培养基,完全培养基,检出缺陷型,完全培养基,基本培养基,影印培养法,检出缺陷型,鉴定缺陷型,含菌基本培养基,含营养物滤纸片,生长谱法,(氨基酸、维生素、碱基等),各种化学诱变剂常用浓度和处理
3、时间,诱变剂使用续1,微生物原生质体融合,原生质体融合,-,原生质体制备：,（1） 根据材料选择破壁酶 细菌：溶菌酶 真菌: Zymolyase-20T，5000T， Novozyme 234，蜗牛酶，纤维素酶， 溶壁酶，崩溃酶， 几丁质酶等 （2） 缓冲液 （3）酶解条件 温度、时间、酶成分配比等,融合,电融合技术： 原生质体在电场中，由于加直流脉冲，膜被击穿，导致融合的发生。 特点： 空间定向，时间同步，显微镜监视 化学因子诱导融合： 聚乙二醇（polyetheneglycol, PEG） Ca 2+ 、Mg 2+ 等阳离子 pH,再生,恢复细胞原貌，能够再生长 高渗培养基 蔗糖 （0.6
4、 M） 山梨醇 (1.0 M) 氯化钠 (0.7 M),基因工程,一、概念 基因工程是指在基因水平上的遗传工程，即用人工方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。所以基因工种是人们在分子生物学理论指导下的一种自觉的能象工程一样可事先设计和控制的育种新技术，是人工的离体的分子水平上的一种遗传重组技术，是一种可完全超远缘杂交的育种新技术，因而是一种最新、最有前途的定向育种新技术。,二、主要操作过程,（一）基因
5、分离 1、分别提取供体细胞（各种生物都可选用）的DNA与作为载体的松驰型细菌质粒（也可用噬菌体或病毒作载体）。 2、根据“工程蓝图”的要求，在供体DNA中加入专一性很强的限制性核酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出粘性末端的DNA单链部分（必须时可人工合成粘性末端）。,（二）体外重组,把供体细胞DNA片段与质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度（56）下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸组成，所以当两者混在一起时，凡粘接末端上碱基互补片段就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链，这时在外加的连接酶作用下，供体的DNA与质粒DNA片段相连，形成了一
6、个完整复制能力的环状重组体“杂种质粒”。,（三）重组载体导入受体细胞内,（四）复制、表达 这种杂种质粒进入受体细胞后，通过自我复制而扩增，并使受体细胞表达为供体细胞所固有的部分遗传性状，这种受体菌，即成为“工程菌”。,（五）筛选、繁殖,质粒，或所带DNA能表达产生一定产物，可通过一选择性培养基或试剂鉴别出来。 原来100000g胰脏仅能提取34g胰岛素，而用工程菌发酵生产，只要几升发酵液便可取得同样数量的产品。,分子育种,容错PCR DNA shuffling,容错PCR（Error-prone Polymerase Chain Reaction, ep-PCR）,Taq聚合酶是从一株耐热细菌
7、Thermus aquaticus中分离获得，由于它缺乏35的校正活性，因此在PCR过程中会插入一些错误的碱基。在通常情况下，发生错误碱基插入的频率为0.12x10-4。通过改变PCR的一些反应条件，可以增加这种错误碱基插入的频率，从而可用来实现基因的定向进化。,在PCR系统中可用于增加碱基错误插入频率的方法,增加MgCl2浓度； 加入一定浓度的MnCl2； 在PCR中采用不平衡的核苷酸浓度； 核苷酸类似物的三磷酸衍生物的混合物.,DNA shuffling,DNA Shuffling 技术 一个或多个不同来源的基因切成片段 无引物PCR扩增 筛选一个或多个所需的性状 重复DNA Shuffling 获得高百分比的功能基因库 主要优点：大大减少与鉴别所需候选产物有 关的成本和时间 难点：设计一个高效的分析和筛选方法,
