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1、病毒的一步生长曲线（one-step growth curve） 感染比（multiplicity of infection, MOI）是指在一个系统中感染病毒的细胞数与细胞总数之比。 在人工培养的细胞中，接种高MOI的病毒，使所有细胞几乎同时受到病毒感染，如分析该培养系统中的单个细胞， 就可以代表病毒在整个体系中所有细胞生长的情况。应用这一方法，可获得病毒一步生长曲线试验的结果（图22-1）， 观察到病毒具有复制周期（replication cycle）。一个完整的复制周期包括吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装与释放等步骤。 病毒感染细胞之后的一个短时间内，病毒完全消失，甚至在细胞内也找不到传
2、染性的病毒颗粒， 直至感染数小时后子代病毒出现为止，这阶段称为隐蔽期（eclipse period），一般持续212h。,在,病毒的遗传与变异,What is a gene? Stable source of information Ability to replicate accurately Capable of change,细菌,外源性的遗传物质由供体菌进入受体菌细胞内的过程称为基因转移（gene transfer)；转移的基因与受体菌DNA整合在一起称为重组(recombination)。细菌基因转移和重组的主要方式有转化、转导、接合。,Frederick Griffiths Tra
3、nsformation Experiment - 1928 “transforming principle” demonstrated with Streptococcus pneumoniae,病毒,第一节 突变 第二节 诱变 第三节 基因重组 第四节 病毒基因产物间的相互作用,准种：由一种母序列和来自该序列的大量突变基因组所组成的病毒群体。 表型的一致性，遗传的动态差异，在变异中保持稳定。,突变,病毒复制过程中单个或者成段的核苷酸序列发生替换、缺失、插入等现象。 缺损型干扰（defective interfering， DI）突变株，突变的特例,缺损型干扰(defective interf
4、ering,DI)突变株,这是一种缺失突变的产物。自身不能复制,只有在亲本野生株作为辅助病毒存在时才能复制,但又干扰亲本病毒的复制,导致后者数量减少。,含正常的衣壳蛋白质 只含有正常基因组的一部分 只能在正常同源病毒同时存在时才能繁殖,这时同源病毒成为辅助病毒(helper virus) 特异性地干扰同源病毒的繁殖,经连续传代后,DI颗粒增多,突变率和适应性,迅速复制的能力 较高的胞内滴度 特定细胞受体的选择 慢性感染以及隐性感染 逃避防御机制 传播方式的适应,诱变,病毒复制时前者可掺入RNA病毒的核酸，后者可掺入DNA病毒的核酸。 定点诱变，在预定的序列位置上插入核苷酸。,1.从生物有机体基
5、因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质.,基因重组,分子内重组 重配,将两个有亲缘关系但生物学性状不同的毒株感染同一个宿主细胞，从而可发生核酸水平上的互换，产生兼有两亲本特性的子代，称为重组。,一、分子内重组
6、,分子内重组： 两种密切的相关但序列不同的病毒核苷酸 病毒与病毒 病毒与细胞,Recombination by break-rejoin of incompletely linked genes,重配 大多数情况下特指基因组分节段的RNA病毒，砂粒病毒 双RNA病毒 布尼病毒 正黏病毒 以及呼肠孤病毒。 两个进化相近的毒株感染同一细胞是，两者 发生了基因的交换，产生稳定或可变的重配 毒株。,二、重配(reassortment),Reassortment by independent assortment during dual infection,病毒进化的例证,粘液瘤病毒与宿主的共同进化 甲
7、型流感病毒的抗原性转移以及漂移,重组的甲型流感在人群中三次大流行： 1918年西班牙流感 1957年亚洲流感 1968年香港流感,人类的感染,流感期間 Camp Funston 的緊急軍事醫院。,禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）,1901年即分离禽流感病毒，但直到1955年才明确它与人及哺乳动物流感的关系，20世纪70年代开始注意在水禽广泛存在的禽流感病毒是流感病毒的“基因库”，并对家禽业构成潜在威胁。 禽流感的高致病力毒株对鸡有致病性，旧称“真性鸡瘟”（fowl plague），现名高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influen
8、za, HPAI）是OIE规定的通报疫病。,病毒毒力有很大差异。 高致病力毒株主要有H5N1和H7N7亚型的某些毒株。 禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不经过猪体混合重配再传染的过程，直接感染人。,国外学者认为，在中国南部生活着密集的人群及养殖大量的猪和鸭，彼此密切接触提供了上述的机遇。 其实除华南之外，东南亚也具有类似情况，2004年禽流感在该地区的广泛流行，似可为佐证。,野生水禽是禽流感病毒的基因库,病毒的变异,甲型流感病毒变异的显著特点是HA和NA发生 遗传性或抗原性漂移（genetic or antigenic drift） 遗传性或抗原性转移（genetic or antigeni
9、c shift）,抗原性变异是HA和NA二者的遗传性或抗原性漂移（genetic or antigenic drift）及遗传性或抗原性转移（genetic or antigenic shift）导致的。 漂移发生在某个亚型之内，是点突变的积蓄，其中和表位与未突变株稍有差异。 转移则骤然获得一个全新的HA或NA基因，从而产生新的亚型，可能在全世界引致新型流感的暴发流行。,随机突变 基因组节段交换 流感病毒抗原性漂移及转移示意（据Harper）,漂移 转移 转移,源于禽类的甲型流感病毒在人体很难增殖，反之亦然 二者均能在猪体内增殖，并在猪体内进行基因重配，猪体是人流感毒株与禽流感毒株的混合器，在
10、猪体内流感病毒产生抗原性转移,甲型流感病毒传播的 经典模式,毒力变异的分子基础,HA是否富含碱性氨基酸。HA裂解为HA1和HA2，暴露融合肽段，通过融合进入宿主细胞。 高致病力毒株与低致病力毒株的H裂解位点的氨基酸序列有差异，前者为-X-X-精氨酸-X-精氨酸/赖氨酸-精氨酸-（X为非碱性氨基酸），而低毒株仅有单个精氨酸，蛋白酶切割率极低，不易裂解。 NA 26个氨基酸的缺失及PB2蛋白氨基酸的突变也影响病毒的毒力。,毒力变异的分子基础,HA是否富含碱性氨基酸。HA裂解为HA1和HA2，暴露融合肽段，通过融合进入宿主细胞，为入侵的关键步骤。 高致病力毒株HA的切割位点有多个氨基端毗连，决定该病
11、毒可被机体大多数组织细胞的蛋白酶裂解。低致病力的裂解位点均只有一个单一的碱性氨基酸精氨酸，只能被胰蛋白酶切割，存在于消化道和呼吸道。 球体表面糖基化位点（影响细胞亲和性），多聚酶复合体的作用（H5N1,NS1变化，破坏细胞内关键信号的转导通道）等。,蛋白酶,催化蛋白质水解的酶类。 种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。 蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键， 如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键,1983年4月在美国宾州发现低毒力的禽流感H5N2，致死率低于10%，它与当时美国东部从野鸟分离的H5N2基
12、因很相似 同年10月，H5N2毒株的致死率突然上升至80%。 将4月及10月的两毒株比较，发现毒力的变异是因点突变所致，亦即发生抗原性漂移 表现为H基因的7个核苷酸二者有差异，从而导致H蛋白的4个氨基酸改变，有利H0的裂解及活化，致使毒力增强,HA和NA两个基因上的变异可以随时间的延长而发生积累，但是流感病毒其他基因的变异在短期内似乎并不随时间的延长而发生积累，可能只是在某一范围内随意振荡而已。这可能是因为流感病毒表面的蛋白质，在和宿主的免疫系统进行赛跑而不断向前进化，而内部蛋白质却一直处于相对稳定的环境。,哺乳动物流感病毒被认为来自禽流感病毒，理由是禽类带有各个亚型的流感病毒，而哺乳动物一般
13、只带有个别亚型的流感病毒；禽类的流感病毒大多数不致病，反映了病毒和宿主之间经过长时间的共同进化达到一种和谐稳定的状态，而哺乳动物流感病毒多有一定致病性。,哺乳动物，特别是人的流感病毒进化较快，而禽流感病毒似乎处于进化停滞状态。 病毒进化的根本目的就是为了增加病毒的多样性，病毒多样性的发展需要从宿主体内获取一定的物质和能量，所以，必然受到宿主环境的制约。首先，旧病毒通过跨宿主转移的方式演化是较为高效的扩增病毒多样性的方式，新病毒稳定后，病毒毒力大多处在中等水平，这是因为毒力太强，最后造成宿主和病毒共同灭亡，双方都不能传代，不利于宿主和病毒双方多样性的发展，将在循环中被逐步淘汰。中等毒力的毒株既能
14、保持一定的病毒数量，又能不断传带下去，呈现一定的优势。,红皇后学说，来源于来维卡罗所描写的爱丽丝历险记中红皇后所说“你必须尽力的不停的跑，才能保持在原来的地方。” “逆水行舟，不进则退”。指侵扰性的寄生物和宿主双方都必须快速变异，以维持存在。,病毒基因的进化特性,新病毒不断产生，从另一宿主的病毒演化而来。 新病毒产生后，在新宿主以较快的速度变异分化。 新病毒产生后，毒力大多处在中等水平。 病毒的进化有随机性，但受到选择的压力呈现方向性。 病毒各个组分的进化呈现不同的速度和特征。,第四节 病毒基因产物间的相互作用,补偿作用（complementation） 表型混合（phenotypic mix
15、ing） 基因型混合（Genotype mixing）,一、补偿作用（complementation）,是指在感染的细胞中，病毒蛋白质之间由于相互作用的结果，拯救了一种或两种病毒或增加了病毒的产量。,Complementation,ts N wt M,ts M wt N,Progeny virus assembled using wt N and wt M proteins Genomes in progeny are either ts M or ts N,和（或）,二、表型混合（phenotype mixing）,两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶尔装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒
16、成分构成的衣壳内，发生表型混合。,PHENOTYPIC MIXING,PHENOTYPIC MIXING,no changes in genome possibly altered host range possibly resistant to antibody neutralization,表型混合特点：,两株病毒混合感染时，装配过程发生错误形成 主要表现为耐药性，抗原性等改变，基因并未改变，改变的生物学性状不能遗传,三、基因型混合（Genotype mixing）,指两种病毒的核酸偶尔混合装在同一病毒衣壳内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，但它们的核酸都未重组合，所以没有遗传性。,病毒的变异研究方法,何谓DI突变株？其特点怎样？ 基因重组与重配的区别。 病毒进化的特征。 病毒基因产物之间的相互作用表现在哪些方面？,
