沈萍微生物学第十五章

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1、第十五章 微生物生物 技术,绪言 1 生物技术及内容 2 生物技术的发展历史 3 微生物生物技术特点及应用 4 微生物生物技术产业化发展,生物技术,基因工程,酶工程,细胞工程,发酵工程,产物,产品,产品,1.1 微生物生物技术 利用微生物进行产品生产,抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、 有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、 生物农药、生物肥料等,医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业,基因工程药物、疫苗及抗体产品,化学工程 生物化工 生物加工行业,近代生物技术,现代生物技术 基因工程菌发酵,抗酒、面包、醋、堆肥,传统生物技术,（1）微生物生物技术 是将微生物学，生物化学和化学工程学的基本原理有机

2、结合起来的一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。 微生物生物技术 涉及 微生物的发酵 （发酵工程） 代谢产物的提纯 （后处理）,（2）.微生物生物技术 -发酵工程的内容 菌种特性与选育 培养基特性，选择及灭菌理论 发酵醪特性，发酵机理，发酵动力学 过滤机理，氧传递，溶解，吸收理论 连续培养，发酵控制与自动化 后处理（下游工程） 细胞破碎，分离，醪液输送，过滤，去杂，沉淀分离，蒸馏，结晶，干燥，包装，及发酵产物分离过程种控制与自动化。,（3）微生物生物技术的特征： 有复杂的生物化学反应 与微生物活细胞息息相关 代谢调控是特色 特有系统：空气除菌系统 培养基灭菌系统,（4）微

3、生物生物技术需解决的问题 菌种问题 合适的反应器 基质的选择 发酵和提纯的比拟放大 过程控制 丝状菌的发酵无完善的理论指导,1.2 微生物生物技术的发展历史,发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物,（1）传统发酵阶段 1667年之前： 嫌气性发酵生产酒类 好气性发酵生产醋类、制曲,微生物生物技术的早期阶段,1680年制成显微镜 微生物的存在 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精 酶,厌氧发酵发酵技术： 19世纪末，用

4、酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。 20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）由食品工业向非食品工业发展,好氧发酵技术： 速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。 1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。,（2）近代微生物生物技术 40年代,1928年由 Fleming发现青霉素 1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究 表面培养： 1升锥形瓶， 40u/ml 1943年沉浸培养： 5m3 200u/ml 当今： 100m

5、3200m3 5-7万u/ml 链霉素、金霉素、新霉索、红霉素,主要的技术进展： 通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。 抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养 基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。 意义： 抗生素工业的发展 建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法 推动了整个发酵工业的深入发展 为现代发酵工程奠定了基础,50年代60年代 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术 酶的活力、 酶量调控(反馈控制和反馈阻遏) 解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用, 突变株的应用,前体、终产物、副产物等应用 发酵动力学，发酵连续化，自动化工程技术 微生物酶反应生物

6、合成与化学合成反应相结合工程技术,(3) 现代微生物生物技术 20世纪70年代之后,细胞融合技术、基因操作技术 1、增加生物体内基因拷贝数， 可以大幅度地提高目标产物的产量 2、 特有产物的控制基因植入细胞中， 快速经济地大量生产这些产物 3、不同性能的多种质粒植入， 以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护,1.3 微生物生物技术的特点,（1）具有生产价值的发酵类型 微生物菌体发酵 微生物酶发酵 微生物代谢产物发酵 微生物的转化发酵 生物工程细胞的发酵,（2）微生物生物技术的特点： 常温常压，能耗小，设备简单 生物体自动调控 农副产品作为原料 易生产复杂的高分子化合物 需防杂菌污染,（3）应

7、用范围 酿酒工业 生理活性物质发酵工业 食品工业 维生素发酵工业 抗生素工业 微生物冶金工业 有机酸工业 核苷酸发酵工业 有机溶剂发酵工业 菌体蛋白发酵工业 酶制剂工业 微生物环境净化工业 氨基酸工业 生物能工业,1.4 微生物生物技术产业化发展,目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约78的速率增长。 我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。 微生物生物技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力,涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题,发酵工业发展趋向,（1）糖分解生产 从简单化合物复杂化合物， 从自然发酵人工控

8、制突变发酵 （2）化学合成产品工业生产全部或部分由 发酵法完成 （3）小规模大型、现代化 （4）糖质原料石油，天然气，纤维素，空气资源,重点方向 （1）微生物育种 （2）生物反应器技术与生物分离技术 （3）微生物数据库，发酵动力学，发酵传力学发展,第一节：工业常用微生物及来源 微生物的特性及工业微生物的要求 一些工业化产品生产菌种的特点 菌种选育,一. 微生物的特性及工业微生物的要求 1、微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,1、菌种能在较

9、短的发酵过程中高产有价值的发酵产品； 2、菌种的发酵培养基应价格低廉，来源充足，被转化为 产品的效率高； 3、菌种对任何动物，植物和环境不应该造成危害，还应注意潜在的，慢性的，长期的，要充分评估。 4、菌种发酵后，不需的产品少，且产品与不需物易分离 5、菌种的遗传特性稳定，易于进行基因操作；,2：工业化生产菌种的要求,3、生产菌种的来源,微生物资源广泛分布于土壤，水，空气 （1）自然环境 （2）收集的菌株筛选 （3）购置生产菌种,表15-2 国际承认的培养物保藏单位,菌种利用总趋势 发酵菌转向氧化菌 野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢控制育种 诱发基因突变转向基因重组定向育种,放线菌（链霉素四

10、环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,1、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,二、 已工业化产品生产菌的介绍,2、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,氨

11、基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,3、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草 芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌 纤维素酶： 木霉 红曲酶; 红曲霉 蛋白酶： 枯草芽孢杆菌、黑曲霉,二、大规模发酵特征,一般认为： 规模大，所用的设备庞大，占用场地大，人力、物力投入的规模大；消耗的原料、能

12、源多；菌种符合生产菌种的要求，其生长代谢特性与大规模发酵相适应；需进行成本核算。,发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方,1、用于好氧菌的发酵罐的结构和应用,大型发酵罐搅拌装置,2、厌氧菌大型发酵罐和其他 生物反应器,3、发酵工程的优化及后处理,表15-3 发酵过程的主要控制项目和方法,附一 温度变化及其控制,一、温度对生长的影响,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长,二、温度影响发酵方向,四环素产生菌金色链霉菌 1.当温度低于3

13、00C时，合成金霉素能力较强； 2.温度提高，合成四环素的比例也提高， 3.温度达到350C时，只产生四环素。 温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,最适温度的选择,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为370C， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C， 青霉菌生长温度为300C。,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速； 在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提

14、高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。,根据生长阶段选择,发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就可以提高温度，刺激产物合成到放罐。 如四环素菌体生长阶段280C，合成期260C，后期再升温； 黑曲霉生长370C，产糖化酶32340C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。 如谷氨酸产生菌生长30320C，产酸34370C。 最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。

15、培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。 培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。 总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,三、发酵过程引起温度变化的因素,（一）发酵热Q发酵,发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。 发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。 在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。,1、生物热Q生物,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。 微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多 一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水 好氧：产生287.2千焦耳热量， 183千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放 厌氧：产生22.6千焦耳热量， 9.6千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放 二个例子中转化为高能化合物分