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1、微生物药物发酵过程,福建省微生物研究所 周 剑 （副研究员 ） 2014.05.23,微生物药物工业生产的组成(原料药）,发酵,分离,菌种,菌种选育,菌种分离纯化,菌种制备保存,摇瓶种子制备,罐上种子制备,发酵生产,发酵液预处理,产物提取,产物精制纯化,微生物药物,（一）微生物药物工业生产菌种,工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。 在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。,工业生产菌株应满足的要求： 能够产生较高浓度的目标产物； 微生物药物工业发酵中高浓度产
2、物一般是胞外产物； 产物便于分离提取； 能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物质等； 不致病，不产生内毒素； 发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，即发酵条件较温和； 容易进行代谢调控。,菌种的选育 1. 寻找产生新化合物的菌种（略） 2. 现有微生物药物产生菌种的选育 目的：a. 提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含量 b. 提高菌种对工业化生产条件的适应力 方法：a. 自然纯化选育 b. 传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束） c. 代谢调控和条件模型选育 d. 基因工程选育,工业用菌种的分离纯化,微生物遗传变异是绝对的，稳定是相对的；退化性的变异是多数的，进化性的变
3、异是少数的。 不对工业用菌种加以分离纯化，剔除变异菌，那么通过传代的累积效应，退化变异菌种将占据种群遗传优势。最终导致生产水平的波动和下降。,菌种分离纯化流程（例）,保存菌种,涂布平板,点种平板,斜面,稀释涂布,单菌落点种,接斜面扩增,生产能力鉴定,斜面,斜面,菌种制备保存方式： 1.短期制备保存 短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。 保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用 于生产。 主要包括：菌落平板 试管/茄子瓶斜面 麸皮/米孢子培养物 2. 中长期制备保藏 中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗 传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。
4、主要包括：冷冻甘油管保藏 冷冻干燥管保藏 液氮甘油管保藏 沙土/石蜡管保藏,基本原则：低营养/干燥/缺氧/低温/密封,（二）微生物药物发酵生产过程,发酵生产流程概况,生产菌种培养,摇瓶种子培养,一级种子 罐培养,二级种子 罐培养,发酵罐培养,微生物药物的发酵生产包括种子培养和发酵生产两个阶段。 种子培养阶段通过连续的扩增培养，获得足够量健壮均一的 种子投入发酵生产。 发酵生产包括生长期和生产期，生长期仍以菌量的扩增为目的；当营养消耗等条件适宜后，微生物即开始产生目标产物，进入生产期。,发酵种子培养过程,迟滞期,对数期,平台期,衰亡期,种子生长曲线,种龄,菌量,种子的评价指标： 生长健壮旺盛，移
5、入下一级后能迅速生长，迟滞期短 菌体稳定均一，生长同步性好 菌体总量和生长密度适宜 无杂菌污染,发酵种子培养的调控 1. 培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。一般而言，种子配方中碳/氮比要求均衡，量以满足生长为宜，优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。 2. 环境因素 影响菌种生理活性的因素包括了温度、pH、溶氧、渗透压、离子强度等。不同的菌种都有着其最适应的范围，从而进行正常的生理代谢。 所有上述因素的选择在种子阶段都应以菌种的生长最适条件来进行选择。 3. 种子级数的设计 种子培养级数越多，
6、培养周期越长，过程中可能出现的不稳定因素越多。在设备条件允许的情况下，应尽可能缩减种子培养级数，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。,发酵生产流程,培养基投料溶解,移入发酵罐定容,调节灭菌前pH值,高压蒸汽灭菌,降温至培养温度,种子液移入,调节空气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵,发酵生长曲线,迟滞期,对数期,平台期,衰亡期,发酵周期,生长期,生产期,次生代谢发酵原理： 当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。,影响发酵的相关因素培养基,1. 碳源 碳
7、源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到5%以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成碳分解代谢物阻遏。 2. 氮源 氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源和有机氮源，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。 3. 矿物盐 磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液
8、pH，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。,4. 生长因子 许多微生物生长需要它们所不能合成的生长因子，如特殊氨基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。 5. 消泡剂 发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等问题。可通过消泡剂的添加控制泡末。一般消泡剂为高分子聚合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果，如豆油、葵花子油等。 6. 前体物质 次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果
9、予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇，达托霉素发酵中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸效价可以提高好几倍。,影响发酵的相关因素培养基,发酵工业中，一些常见前体物质,前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 如苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%，癸酸必须培养15h后加入。 前体添加过多，容易引起挥发和氧化，分解等。 因此，前体在使用过程中，常采用流加方法。,用法：前体普遍采用流加的方法， 流加有利于提高前体的转化率。,产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,产物促进剂,促进剂提
10、高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的（机理不详）。 有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产； 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，再转为天然培养基，以扩大生产。 在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种农副产品、工业副产品、废料等。 开发天然培养基时，应考虑： 新选微生物及其工艺的特殊营养需求； 为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件； 原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响； 培
11、养基价格。,发酵培养基设计,培养基优化,（1）目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。 （2）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的经验配方。 （3）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,培养基优化的基本原则,注意事项： （1）菌种特性，同化能力 （2）合适的C、N比。 （3）合适的快速利用碳源、氮源。 （4）合适的生理性酸性与碱性 （5）pH、离子强度等,没有最好，只有更好,提高生产率,降低物耗、能耗、三废排放,提高发酵单位,缩短生产时间,价廉的原
12、料替代，降低成本,培 养 基 优 化 目 标,方法,结果,培养基优化的基本方法,影响发酵的相关因素培养条件,1. 温度 温度影响微生物酶系的活力，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。 2. pH pH对微生物的影响，主要也是作用于酶。另外对营养利用和细胞结构也有重要影响。无控制的条件下，pH 呈现如下变化规律。,有机氮分解，形成大量NH4+,NH4+消耗利用 碳源消耗产生有机酸,菌体老化，进入鸟氨酸循环形成大量NH4+,菌体
13、二次生长,影响发酵的相关因素培养条件,pH的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如盐酸、氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同时也兼具营养补充功能。 3. 氧的供应 工业微生物大都为好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。 反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。 类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量
14、、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵黏度、泡沫等因素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。,影响发酵的相关因素培养条件,4. 灭菌条件 发酵罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致营养损失和毒性物质积累。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制微生物发酵也是常用的手段。 5. 剪切力 发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但桨叶尖端末速形成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。 对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，
15、提高菌种抵抗能力。在设备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨叶。,影响发酵的相关因素其他因素,1. 种子质量的影响 2. 设备的影响 良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失效导致染菌问题；搅拌不平衡导致罐体震动，影响供氧；开关阀门动作失灵导致温度、pH控制不稳等等。 3. 人员操作的影响 人员操作是发酵生产控制的重要因素,对发酵生产各环节都有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗略和错误的影响。 4. 环境因素 环境因素往往导致发酵水平的季节性波动。如环境空气的温湿度会使无菌空气的温湿度有差异，
16、导致培养体积随时间的增减，影响发酵环境。,（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）,发酵终点的判断,1. 发酵的评价指标 发酵产率：单位体积的产物含量 g/L 发酵总亿：发酵液中产物总产量 十亿单位/kg 发酵系数：产物总产量/总发酵体积*总发酵时间 kg/m3*h 发酵成本：发酵(原料+动力+人员+其他)成本/总产量 元/kg 2. 终点判断标准 发酵终点的判断主要从技术和经济指标两方面来衡量。技术上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。 从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同时也应兼顾分离提取需要。,（三）发酵系统介绍,（三）发酵系统介绍,工业发酵搅拌器技术的发展,适用发酵过程的搅拌器,径向流圆盘搅拌器： Rushton涡轮 半弯管圆盘涡轮 BT-6 轴向
