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1、,微生物知识及环境测试 操作规程,主要内容,一、微生物学基础知识 二、环境测试概述 三、工艺用水的微生物检查,一、微生物学基础知识,1、微生物的概念： 微生物是一群个体微小，结构简单，肉眼不能直接看到，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大几百、几千甚至几万倍才能看到的微小生物。,2、微生物的分类： 按照微生物有无细胞结构、分化程度和化学组成等 不同，可分三种类型： 1）非细胞型微生物：体积小，能通过细菌过滤器，无细胞结构。 如病毒（HBV 、 HCV 、HIV） 2）原核细胞型微生物：由单细胞组成，细胞核分化程度低，仅有原始核。如细菌，放线菌，螺旋体等 3）真核细胞型微生物：多细胞组成，细胞核分
2、化程度高，有典型的核结构。 如真菌（霉菌，酵母菌），藻类,细胞壁 基本结构 细胞膜 细胞质 3.细菌的结构 核质 荚膜 特殊结构 鞭毛 菌毛 芽孢,芽孢： 对高温、干燥、化学消毒剂和辐射等 有较强的抵抗力。芽孢具有菌体的酶、 核质等成分，能保存细菌全部的生命活性， 芽孢代谢相对静止，不能分裂繁殖。 但芽孢若遇到适宜的环境条件，又可吸水 膨大，酶活性恢复，形成新的菌体。,4、细菌的营养 水：是细菌吸收营养，渗透，分泌，调节体温的一切媒介. 碳源：细菌主要从含碳化合物如糖类，有机酸等获得碳源. 氮源：细菌多以有氮化物如氨基酸，蛋白胨或肉汤等作为氮源 无机盐：细菌需要无机盐提供细菌生长的各种元素，常
3、用元素P，S，K，Na，Mg，Ca，Fe。 生长因子,5、物理因素对细菌的影响 高温： 细菌主要由蛋白质组成，而蛋白质在高温下易发生变性和凝固，酶的活性随之消失。 低温： 细菌在低温条件下，代谢活动大大降低， 能较长时间维持生命，该方法常用来保 存菌种。,紫外线： 光谱中对生物危害最大的部分,是一种电磁辐射(紫外光波长190nm-350nm之间).紫外线的杀菌作用与他的波长有关，波长在210-300nm之间有杀菌作用，其中在265-266nm之间最强。,紫外线杀菌机制： 当微生物被紫外线照射后，细胞内DNA吸收紫外线，DNA一条链或两条链上相近的胸腺嘧啶之间形成二聚体，改变DNA的分子结构，从
4、而干扰DNA的复制以达到杀菌的目的。但是紫外线穿透能力差，不能透过 普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸气，只能 用做物体表面消毒。,超声波： 人类听觉能感受到的频率在9000赫兹/秒以下，高于20000赫兹/秒者为超声波。 杀菌机制： 超声波通过液体时发生空化作用破坏细菌的原生质态导致细菌死亡,达到粉碎细胞的目的.,过滤： 用机械阻留的方法将液体或气体中细菌除去，适用于不耐热也不能用化学方法消毒的液体或空气. (空调净化系统中的过滤装置),6、几个常用概念 1)消毒：指杀死物体表面病原微生物的方法，但不一定杀死细菌的芽孢或非病原性微生物。用于消毒的化学药物称为消毒剂。 常用的消毒剂：表面活性剂（新洁而
5、灭)、 醇类（乙醇）、氧化剂（臭氧）等。,2)灭菌：是指杀死物体上所有微生物的方法。包括病原菌，非病原菌及芽孢。 3)无菌：是指不含活菌的意思。（A级区域） 4)抑菌：是指抑制体内或体外微生物的繁殖。 多数抑菌剂为抗生素。,二、环境测试概述,环境测试检验操作规程（2-03000-02 ） 一、 制定依据： 新版GMP 医药工业厂房设计规范 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法 （GB/T 16293-2010） 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法 （GB/T 16294-2010） 医药工业洁净室和洁净区悬浮子的测试方法（GB/T16292-2010）,二、适用范围 三、责任者 四、主要仪器
6、设备 五、培养皿和培养基 六、相关定义 菌落 浮游菌 沉降菌 悬浮粒子 单向流 非单向流 纠偏限度 警戒限度 置信上限 静态 动态,七、检验内容 1、培养皿制备 2、浮游菌测试 3、沉降菌测试 4、悬浮粒子测试 5、手和洁净服的测试 6、评定标准（警戒限度）（纠偏限度） 7、超标处理 8、检查周期 9、记录报告,八、相关记录 九、附录 房间信息表 沉降菌监测点布置图 十、变更记载,测试内容： 1、采样点位置 2、最少采样点数目 3、最小采样量 4、操作过程 5、培养观察 6、结果计算与判断 7、注意事项,沉降菌和浮游菌 将已制备好的培养皿按最少采样点数目和最小采样量的规定逐个放置，然后从内到外
7、逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。 静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上，动态测试时培养皿暴露时间为不大于4h。,每个采样点采样结束后培养皿盖上做好标记，包括测试项目、测试区域、测试房间 及级别、测试状态（j/d）、培养皿暴露时间、测试人、测试时间等。,测试前应仔细检查每个培养皿的质量，培养基及培养皿有变质、破损或污染的不能使用。 测试者在测试时应统计暴露培养皿的个数并保证测试结束后全部收集，切勿将培养皿落在测试区域造成污染。 布置采样点时，应尽量避开尘粒较集中的回风口至少1m以上。,对于单向流或送风口，采样器采样管口应朝向正对气流方向，对于非单向流，采样管口应向上放置。 采样
8、时，测试人员应站在采样口的下风侧， 并尽量少走动。 进行动态测试时，应避免对洁净区造成不良影响。,悬浮粒子 采样器在进入洁净区之前应先用消毒剂擦拭外表面后经传递窗传入。 判定洁净等级所列0.5m和5m两种粒径，测定时均须测定。对于所产生粒子不影响最终产品质量的作业（如粉碎、制粒等操作），作业时可允许超出警戒指标，但作业完成10min后，粒子水平必须满足此洁净区洁净级别的要求。,在确认级别时，应当使用采样管较短的便携式尘埃粒子计数器，避免5.0m悬浮粒子在远程采样系统的长采样管中沉降。 长时间测试或高浓度测试后应对采样器内部进行清洗。,手的微生物监测： 可采用随机抽查的方法在洁净厂房二更和洁净区
9、关键操作点确定受检者，受检者先后用大拇指、四指上部及手掌轻按培养基表面并保持约30秒。采样后，受检者须洗去手上残留的琼脂,如样品取自乳胶手套，手套应作更换。,洁净服的微生物监测： 采样时，至少取3个样，在操作人员洁净服的前襟和袖口处轻按一下，合盖。采样后，受检者须更换洁净服。,应在关键操作完成后对操作人员的手进行采样。 采样过程中，应避免测试者和被测试者对培养基的污染。 采样的全过程应避免对洁净区的污染。,采样完成后，应对培养皿做唯一性标记，包括测试项目、被测试者及所在工段、测试区域、测试人、测试时间等。 采样结束后，应对采样点进行彻底消毒。,三、工艺用水的微生物检查,1、工艺用水的定义： 水
10、是药物生产中用量最大、使用最广的一种辅料，用于生产过程及药物制剂的制备。 （中国药典2010版） 2、分类： 根据使用范围不同，分为饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水。,3、工艺用水的一般检查程序 工艺用水各监控点由化验室进行监测 ，可采取周期性取样的方法进行，在监测周期内必须分次监测各使用点，并且确保各使用点在一个监测周期内均能监测到。,针对不正常生产车间，水系统不正常运行，具体措施如下： 对停产超过15天的车间，在生产前由该车间提前3天向化验室开具请验单对其工艺用水所有使用点进行检测，组织生产前该项目必须检查合格。,1、取样器具 纯化水：500ml灭菌硬质玻璃瓶 微生物检查 注射用水：
11、1000ml灭菌硬质玻璃瓶 物理和化学检查：1000ml干净硬质玻璃瓶 细菌内毒素检查：50ml灭菌硬质玻璃瓶,2、取样方法 1）取样前，正常情况下，将阀门完全打 开，放水1min取样；不正常生产车间放水 至少30min。 用酒精消毒棉擦拭手和指甲缝，擦拭 取样用具外壁.,2)取样 用灭菌玻璃瓶接水，冲洗2次，再接水至少 500ml/1000ml做微生物检查。另用干净玻璃瓶接水冲洗2次，再接水至少1000ml做理化项目检查。 3）取样后 在取样容器上贴签，标明品名、批号、来源、取样人，用做微生物检查的水样容器瓶口须具有有效的防污染和防尘措施。,3.取样容器的洗涤 照“实验室玻璃仪器清洁规程”清
12、洁。 1）用作微生物检查用的容器： 121湿热灭菌15min或160-170 干热灭菌2h以上，烘干备用，超过1 天使用时须重新灭菌；,2）用作细菌内毒素检查的容器： 250干热灭菌1h以上，在不开启容器包装的情况下，可在三天内使用，否则需再次加热除去可能存在的外源性内毒素。 3）用作理化检查用的容器清洗后 倒置自然晾干，备用。,4、注意事项 1）在同一个水源，同一个时间采取几个水样时，用作微生物检查的水样应先取，以免采样点被污染。 2）进行微生物检查的水样，应在取样后4h内检查，否则须将样品在37保存并在6h内检查。进行理化性质、感官性状检查的水样，应在6h内检查。,3)对使用了不合格工艺用水所涉及的 产品应作增补性细菌内毒素和微生 物检查,以此为依据考虑产品受污 染的可能性和限度。,5.检验方法 1)纯化水按照“纯化水检验操作规程” （SOP2-03051）检验。 2)注射用水按照“注射用水检验操作规程” （SOP2-03084）检验。 3)生活饮用水按照“生活饮用水检验操作规程” （SOP2-03052）检验。,6、工艺用水的微生物检查 生活饮用水：100cfu/ml； 纯化水：100cfu/ml （内控标准70cfu/ml）； 注射用水：10cfu/100ml,谢 谢 ！,
