微生物的遗传变异和育种_3

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1、第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变 基因突变简称突变，是指细胞的遗传物质DNA在分子结构发生了改变，从而引起细胞表型发生可遗传的改变，可自发或诱导产生。,狭义突变专指基因突变（点突变）：DNA分子上少数碱基对的缺失、插入或置换，结果仅影响少数基因的功能，有重要的生物学意义； 广义的突变包括两种类型： 染色体畸变：大段核苷酸序列的缺失、重复、倒位，往往造成细胞死亡。 基因突变(点突变),突变的几率一般在106 109范围内。,基因突变的表型效应突变株,相对于野生型菌株，基因突变使细胞不仅在遗传型上发生改变，同时在表型上也发生改变，产生突变型菌株； 野生型菌株：从自然环境中分离得到的菌株，以

2、及它所具有的遗传型； 突变型菌株：相对于野生型菌株，由于基因突变而导致遗传型发生改变，所形成的具有新的表型的菌株；,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分： 选择性突变株（selective mutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株（non-selective mutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,（一）基因突变的类型,1、营养缺陷型（auxotroph）,由于基因突变，使某种酶失

3、去了正常的功能，导致该酶催化的生化反应不能进行，影响了某种代谢物的合成；细胞需从外界摄取这种代谢物才能正常生长； 营养缺陷型是野生型菌株的变异株，营养缺陷型不能象野生型一样在基本培养基上生长，需要补加生长因子才能正常生长；,表型判断的标准：在基本培养基上能否生长,特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC、trpA （其中的大写字母C和A表示同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,在具体使用时多用hisC-和hisC+，分

4、别表示缺陷型和野生型。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和 育种的重要手段,2、抗药性突变型（resistant mutant）,由于基因突变，导致细胞结构或代谢途径发生改变，对某种药物或抗生素产生抗性或不敏感； 它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。,正选择标记 （突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的 平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示 strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性,3、条件致死突变型（conditional lethal mutant）,某菌株或病毒经基因

5、突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型，称为条件致死突变型。 常见的条件致死突变型是温度敏感突变型，用Ts（temperaturesensitive）表示； 如：E.coli的某些野生型在37时能够正常生长，在42时死亡；但可以在低温下正常生长； 原因是突变使某些重要的蛋白质的结构和功能发生改变，在某特定温度下具有功能，在另一温度（一般为较高温度）下没有功能。,负选择标记,4、形态突变型（morphological mutant）,因基因突变产生相对于野生型的细胞形态改变；突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。 如可影响孢

6、子有无、孢子颜色、鞭毛有无等以及菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突变。 细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。,5、抗原突变型（antigenic mutant),由于基因突变而引起的细胞抗原结构的变化。 如细胞壁缺陷型（L型细菌等）、荚膜变异或鞭毛变异等。,6、产量突变型,由于基因突变细胞积累某种代谢产物的能力发生变化，可分为“正变株”和“负变株”。 正变株是基因突变后获得的有用代谢产物高于原始菌株的突变株，又称高产突变株。反之称负变株。 这在实际应用中具有重要意义；,定义：某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次

7、突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的回复突变株（back mutant或reverse mutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。,（二）突变率,若干细菌某一性状的自发突变率,菌

8、名 突变性状 突变率 E. coli 抗T1噬菌体 3 108 E. coli 抗T3噬菌体 1 107 E. coli 不发酵乳糖 1 1010 E. coli 抗紫外线 1 105 Staphylococcus aureus 抗青霉素 1 107 S. aureus 抗链霉素 1 109 Salmonella typhi 抗25g/L链霉素 1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5 105,（三）突变的特点,适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 稀有性：突变率

9、低且稳定。微生物的自发突变率为10-610-9 独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 可诱发性：诱变剂可提高突变率（10105倍 ）。 稳定性：变异性状稳定可遗传。 可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突 变（forward mutation），从突变株回到野生型的 过程则称为回复突变或回变（back mutation或 reverse mutation）。,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。 一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来

10、的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。 另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。 从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理设计。,1. Luria等的变量试验fluctuation test,Salvador Luria,Max Delbr

11、uck,说明抗噬菌体突变体是在接触噬菌体前在一次细胞分裂过程中随机自发产生的。这一自发突变发生得越早，则抗噬菌体菌落出现得越多，反之越少。抗噬菌体突变体的出现与是否接触噬菌体无关。,2.Newcombe的涂布试验（1949）,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。,涂布试验中突变率的计算,初始接种量：5 104 个/皿 培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌 这时，每个平皿上的细胞数为： 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6 （2.6 108 5 104）= 15.6 108 在未涂布的平板上共发现28个突变，故

12、 突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,3. Lederberg等的平板影印培养试验（replica plating）,1952年，J. Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。,Joshua Lederberg,平板影印培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法。 把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱上，使其上沾满来自培养皿平板上的 菌落，然后可把这一“印章“上的 菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上，待

13、这些平板培养后，对平板相同位置上的菌落对比后，就可选出适当的突变型菌株。,说明在根本未接触过任何一点链霉素的条件下，就可筛选到大量抗链霉素的突变株。 影印平板培养法在遗传学基础理论研究、育种实践和其他研究中发挥重要作用。,（五）基因突变及其机制,基因突变的原因是多种多样的，可以是自发的或诱发的,自发突变：由细胞内部环境因素，或DNA自身结构特点而引起的偶然突变；一般发生频率为10-610-9 ； 诱发突变：物理、化学或生物因素作用于DNA ，直接改变DNA的结构，或增加DNA分子结构的不稳定，或增加DNA复制时发生错误的几率而产生的基因突变；,具体类型可归纳如下：,1. 诱变机制,定义：简称诱

14、变，是指通过人为地方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变的频率。 诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂。 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。 按照遗传物质结构变化的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作用机制。,（1）碱基置换（substitution）,定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。 分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶

15、所置换； 颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,碱基的置换引起的突变,错义突变；某个碱基的置换改变了三联体密码子的含义； 无义突变：某个碱基的置换产生终止密码子UAA、UAG或UGA；同义突变：某个碱基的置换没有改变三联体密码子的含义；,对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,直接引起置换的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。 种类：很多。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，

16、甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。 羟胺只引起GCA : T， 其余都是可使GC=A : T发生互变的。 能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有（参见下表）。,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。 HNO2 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） HNO2 腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H） HNO2 鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X） 这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例,