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1、5. 2 微生物的菌种选育,5.2.1. 自然界工业菌种筛选程序 5.2.2. 微生物的诱变育种 5.2.3. 微生物的杂交育种 5.2.4. 原生质体育种 5.2.5. 基因工程技术用于工业菌种改良,选种、育种、复壮、适合的工艺设备,1. 自然界工业菌种筛选程序,1) 采样 土壤为主，也包括植物、腐败物、水样。 2) 增殖培养 3) 培养分离 4) 筛选 5) 毒性试验,采样、增殖培养、培养分离、筛选、毒性试验,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前
2、发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,2 微生物的诱变育种,2.1 诱变育种的步骤和方法,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,步骤：,诱变育种的基本过程：,选择选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,1.出发菌株的选择： 出发菌株：用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型
3、菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2.制备细胞悬液 要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）; 方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。 制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 产生原因： 分离性迟延现象 生理性迟延现象,3.诱变处理： 诱变剂的作用： 提高突变
4、的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。 最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）,选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。 简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。
5、 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。,常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 物理诱变剂有紫外线、x射线、射线(如Co60等)、等离子、快中子、射线、射线、超声波等。 化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。,物理诱变剂中最常用的有紫外线。简
6、便、经济、效果好。广泛应用于工业育种。 紫外线波长范围为136300nm，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。 脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。,紫外诱变的方法： 10m1菌悬液 9cm培养皿 启动磁力搅拌器 15w紫外灯照射 避光培养 照射距离为30cm，照射时间几秒数十分钟，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热2030min，然后再进行处理。,不
7、具电离作用，诱变率与时间有关,60Co属射线，是一种高能电磁波 直接作用：化学键的断裂 间接作用：产生自由基引发突变 一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在410万伦琴，或者采用能使微生物产生9099死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。,有电离作用，突变率与时间无关。,等离子输入是一种较新的诱变方法，由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件。是电、能、质的联合作用。,有电离作用，突变率高，突变谱广，回复突变率低。,化学诱变剂 1 烷化剂，引起碱基转换。 二乙酯、亚
8、硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N-亚硝基胍、亚硝基甲基尿等。 2 碱基类似物，渗入到DNA分子中。 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。 3 吖啶类，增加或减少一、二个碱基。 “超诱变剂” 亚硝基胍和甲基磺酸乙酯。甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因其回复突变率高，效果不大。,决定化学诱变剂剂量的因素： 诱变剂的浓度（几微克几毫克毫升）、作用温度、作用时间。 预试验：处理浓度、处理温度确定 不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。 终止反应：稀释法、解毒剂或改变pH值。 低剂量正突变多，高剂量更容易出现负突变。 多采用
9、较低剂量。,复合处理方法：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。,（5）中间培养 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,平皿快速检测法 纸片培养显色法 变色圈法
10、 透明圈法 生长圈法 抑菌圈法,（6） 分离和筛选,平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。,菌种筛选,1 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指
11、标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,第一轮： 一个出发菌株选出200个菌株选出50株 选出5株,诱变处理,初筛,（每株一瓶）,复筛,（每株四瓶）,第二轮： 5个出发菌株 选出50株 选出5株,40株 40株 40株 40株 40株,诱变处理,初筛,复筛,（每株一瓶）,（每株四瓶）,2. 营养缺陷型突变体的筛选及应用,营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其
12、变异前的菌株称为野生菌株。,基本培养(MM)凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基；在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养基(CM)；在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基(SM)。,营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。,诱变：与其他诱变相同。百分之几到千分之几。 淘汰野生型菌株：抗生素法（细菌、酵母菌），菌丝过滤法（丝状真菌）。 检出方法：影
13、印法、夹层法、逐个检出法、限量补充营养法。 确定生长谱：以不同营养组合来区分是什么缺陷型（氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素）,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体： 营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys -， bio- 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。 如：lys + ; bio + ; 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,营养缺陷型(auxotroph)的筛选,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是
14、能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,营养缺陷型诱变筛选步骤及方法,auxo的鉴定,诱变处理,auxo的浓缩,auxo的检出,缺陷型的浓缩：,抗生素法 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。 方法：将菌培养在含抗生素的MM基中,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,逐个检出法：,缺陷型的
15、检出：,影印平板培养法,夹层培养法,生长谱法 方法简便； 回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片,缺陷型的鉴定：,测定一般应分两阶段： 第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型； 第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,营养缺陷型菌株的应用： 利用营养缺陷型菌株定量分析各种生长因素的方法称为微生物分析法。 分析食品中氨基酸和维生素的含量 作为研究转化、转导、接合等遗传规律的标记菌种和微生物杂交育种的标记 用于测定微生物的代谢途径 作为提高某种生长素的生产能力的菌种。如利用丝氨酸营养缺陷型可以生产更多的赖氨酸，利用腺苷酸营养缺陷型菌株可提高肌苷酸的产量,4.3.
16、 微生物的杂交育种,杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结、细胞核融合，随后细胞核进行减数分裂，遗传性状会出现分离和重新组合的现象，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌,原生质体融合育种的步骤：,4.4. 原生质体育种 原生质体融合、原生质体转化，原生质体诱变育种,标记菌株的筛选和稳定性验证,原生质体制备,等量原生质体加聚乙二醇（PEG)促进融合,涂布于再生培养基,再生出菌落,选择性培养基上划线生长,分离验证,挑取融合子进一步试验保藏,生产性能筛选,4.5. 基因工程技术用于工业菌种改良,基因工程技术又称基因操作、基因克隆、DNA重组等，
