微生物的菌种选育和保藏

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1、第二章 微生物菌种的选育 和保藏,第一节 微生物发酵的 关键因素菌种,细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的生物。,一、现代发酵工程中常用的微生物菌种 及代谢产物,1.细菌,分布最广，数量最多，单细胞原核，二分裂殖. 枯草芽孢杆菌- 淀粉酶、蛋白酶 嗜热乳杆菌-乳酸 醋酸杆菌-醋酸 棒状杆菌-氨基酸 短杆菌-肌苷酸,质粒 (plasmid)：,特点： (1)它是裸露的环状DNA分子，所含遗传信息量为2200个基因，能进行自我复制，有时能整合到核DNA中去。 (2)细菌可以失去质粒DNA而无妨于正常代谢活动。 (3)质粒DN

2、A在遗传工程研究中很重要，常用作基因重组与基因转移的载体。,定义：除核区DNA外，还存在可进行自主复制的遗传因子，称为质粒。,2.放线菌,原核生物，在有机质丰富的，微碱性土壤中， 无形胞子或菌丝片断繁殖。 生产菌种: 链霉菌属、小单孢菌属、诺卡菌属等。 产品: 链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。,它的最大经济价值在于能产生多种抗生素，从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的。,放线菌菌落形态,放线菌菌丝,放线菌,3. 酵母菌,单细胞真核，含糖，偏酸，腐生，出芽繁 殖，假丝. 啤酒酵母-酿酒、细胞色素C、单细胞蛋 白、 甘油、琥珀酸 假丝酵母-面包、石油脱蜡、饲料 类酵母-脂肪酶,酵

3、母菌,4. 霉菌,丝状真菌 生产菌种：根霉、毛霉、红曲霉、青霉等 产品：酶制剂、抗生素、有机酸、甾体激素,霉菌,其他生物： A: 担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖、抗癌药物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。,B：藻类（alga）：,培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆28倍。 还可通过藻类将CO2转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%，

4、合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。此项技术还可减轻因工业生产而大量排放CO2造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。,藻 类 工 厂,2.1.2 发酵工业对微生物菌种的要求,根据资料直接向有关科研单位、高等院校工厂或菌种保藏部门索取或购买。,从大自然中分离筛选新的微生物菌种,生产中选种,菌种来源,2.1.3 从自然选种,新种分离与筛选的步骤： 1. 定方案：查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：有针对性地采集样品。,2.1.3 从自然选种,3. 增殖培养：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养

5、后，在数量上占优势。 4. 纯种分离：利用分离技术得到纯种。 5. 性能测定：进行生产性能测定。,采样,1. 制定方案,调查研究，查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性，设计实验方案，开始进行菌种筛选。,工业生产上的微生物菌种最初都是从自然界中筛选出来。自然界的微生物种类非常多，分布广最合适的地方去采集菌种。,2. 样品采集,从自然界筛选,土壤是微生物的大本营，种类多，数量大，因而是最常采集样品的地方。采土的时候，以下几点值得注意： （1）土壤肥瘦：有机质较多的土壤含微生物也多。肥土细菌多。园林土、农田土放线菌为好。分离真菌，采集富有植物残体的土样较为合适。,根据目的到最合适的地方去采集菌种。,

6、（2）采土深度：表层干燥，微生物较少。5-20 cm处较好。 （3）采土季节：以春秋二季为宜。雨量不多的秋初为好。 （4）采土方法：选择地点用小铲子除去表面取5-20cm处的土壤几十克放入事先灭过菌的纸袋内。 同时记录采土时间、地点、植被等情况以备查考。采土的点可多些，采土后要尽快分离。,水样采集方法,将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。 方法是：应取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞的瓶，瓶口朝下浸入水中，然后反转过来，打开瓶盖，让水样进入。水样不应装满采样瓶。 所有水样都应在24 h之内迅速进行检测，

7、或4 下贮存。,从植物体采集方法,在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。 将取下的组织，用无菌溶液把其中的微生物洗涤下来，进行分离。,从植物体采集方法,采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。 取内生菌的时候，先将植物根、茎或叶进行表面消毒，然后切取的一小块（纵剖开），放入培养基中培养。,3. 增殖培养,原因：采集到的样品，可能含有我们所需要的微生物，但数量较少，而且杂菌混生，因而不易直接

8、分离纯化，需要增殖培养。 方法：往样品中加入适合某些微生物生长繁殖的物质，或创造适合某些微生物生长繁殖的环境条件，这样就促进了某些微生物的大量繁殖。,营养条件方面的控制； 通气条件的控制； 培养基酸碱度的控制； 根据特殊的生理特性而采用的方法； 添加特殊的抑制剂。,1）培养基中加入一些石油，能利用石油的微生物容易生长繁殖； 2）把土样加入到含糖浓度高的培养基中，并把pH值调到4以下，就可使酵母菌得到增殖。 3）要筛选芽孢杆菌，先将样品加水后于80处理10分钟，非芽孢菌迅速死亡，使芽孢杆菌的浓度得到提高。,举例：,定义：是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。 方法：根据不

9、同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。,选择培养基,一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的。如： 利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物； 利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物； 缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。,另一类选择培养基是在培养基中加人某种化学物质这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。如： 加入数滴10酚可以抑制细

10、菌和霉菌的生长，用于分离出放线菌； 加入亚硫酸铋，可以抑制和绝大多数细菌,而G-的伤寒沙门氏菌可以在这种培养基上生长.,加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制G+细菌生长，从而达到分离G-细菌的目的 加入青霉素、四环衰或链霉素,可以抑制细菌和放线菌生长，而将酵母菌和霉菌分离出来。 现代基因克隆技术也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种(些)抗生素的抗性选择标记，在培养基中加人相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。,4. 纯种分离,将增殖培养效果显著的优势菌种，进一步控制增殖培养的选择性条件，采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获

11、取单菌落。,(1) 平板划线分离法（最常用的方法）,b.,连续划线分离法,分区划线分离法,1.稀释平皿分离法,(2) 稀释分离法,100 ml,1g,9 ml,9 ml,9 ml,9 ml,9 ml,9 ml,1/100,1/1000,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4,1 ml,1 ml,1 ml,1 ml,1 ml,十倍稀 释,将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）,使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。,b.倾注平皿分离法,a.涂布平皿分离法,（3）涂布分离法,（4）毛细管分离法、小

12、滴分离法 及显微操纵仪法,这是较为精细的单细胞或单孢子分离法，达到纯菌株的水平。如毛细管吸取菌液等。,5、性能测定,1）粗测: 起定性的作用，一般在培养皿上进行 例如：要测定某菌是否产生蛋白酶及其活力大小，可在酪素平板上看有无透明圈及其大小 2）精测: 起定量的作用。试验要接近生产工艺条件 粗测工作量大，精测手续繁琐，如二者结合，则可提高效率。例如： 1）柠檬酸生产菌黑曲霉的选育:采用微量滴管接种,纸片培养方法，根据指示剂变色圈直径的比值进行初筛 2）蛋白酶生产菌酱油曲霉的选育:根据酪蛋白培养基上透明圈直径和菌落直径的比值进行初筛；,（1）平板快速检测法,抑菌圈法,透明圈法,变色圈法,生长圈法

13、,此法常应用于氨基酸、核苷酸 、维生素等缺陷型菌株的选育。,（2）梯度平板法,2.1.4 从生产中选种,（1）抗噬菌体菌株的选育 （2）菌落形态变异菌株的选育 （3）利用环境的选择作用来选育,补充：菌种的分类鉴定,多相分类指把传统的表型分类、数值分类、化学分类和分子分类等各种信息综合考虑，来确定菌株的分类地位。能更客观合理的反映生物间系统进化关系。,1. 表型分类,定义：主要依靠培养和生化等表型特征进行分类鉴定，这就是表型分类法。 最常规的表型特征包括形态特征、培养特征、生理生化特征。,2.数值分类,数值分类是一种定量分类方法，是通过计算分析大量的特征（50），计算出相似值来考察菌株间的相互关

14、系，是建立在计算机应用上的一种分类方法。,3.化学分类,化学分类是依据生物细胞中某些特定化学物质的特征对生物个体进行分类的方法，是菌株划分的主要方法之一。 主要化学指征包括: 细胞壁化学组分分析、枝菌酸、脂肪酸、磷酸类脂、甲基萘醌、全细胞蛋白及核糖体蛋白电泳分析。,4.分子分类,化学分类是借助于分子生物学技术对生物个体进行分类的方法，是现在分类的主要方法。 主要包括G+C mol%测定、DNA杂交、核酸结构分析、DNA指纹图谱分析和变性梯度凝胶电泳。,基于16S rDNA 序列构建的BH0951 菌株的系统发育树,第二节 微生物选育种,有诱变育种、杂交育种、转化、转导、原生质体融合及基因工程技

15、术等重要手段。 这些重要技术对工业微生物的改良起着重要的作用。,菌种选育的方法,2.2.1 诱变育种,定义： 通过诱变剂处理来提高菌种突变的频率，扩大变异 范围，从中选出优良特性的变异菌株的育种方法 特点： 基因突变频率高（10-310-6），自然突变仅10-9 速度快、收效大、方法简便 是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 工作量大，缺乏定向性,诱变,物理、化学或生物诱变方法,（一）诱变育种的基本步骤,1. 基本步骤 （1）出发菌株的选择 （2）菌悬液的处理 （3）诱变的处理 （4）中间培养 （5）分离和筛选,2. 诱变筛选的典型流程： 出发菌株 取高产斜面 斜面 菌种保藏 单孢子悬液 转

16、接斜面 诱变处理 摇瓶复筛 稀释涂布平皿 高产菌株（稳定性试验） 单菌落转接斜面 中试考查 摇瓶初筛 生产,（1）出发菌株的选择,出发菌株即用于育种的原始菌株。选择好出发菌株，相当重要。一般出发菌株来源： 1）来源于自然界直接分离的野生型菌株 2）选用已经经过生产条件考验的菌株； 3）选用几次诱变处理均能提高产量的菌株； 4）选用形态发生变异以后的菌株等。,（2）菌悬液的处理,1） 悬浮液：用生理盐水或缓冲液来制备。 细菌：对数期的细胞。 真菌和放线菌：刚成熟的孢子。 制备方法：微生物细胞液体中呈分散、悬浮状态均匀接触诱变剂。 通常采用：用灭过菌的玻璃珠把成团的细胞打碎，再用灭过菌的脱脂棉进行过滤。,2）尽量处理单核细胞防止长出不纯菌落。 酵母菌: 一