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1、,微生物生长繁殖与遗传变异,重点内容提示： 细菌等单细胞微生物的生长繁殖规律，在废水处理等实际应用中的指导意义。 细菌等微生物遗传变异的原理，利用微生物的变异性改变微生物菌种性能的途径与方法。,1. 单细胞微生物生长繁殖曲线,几个概念 生长：个体增大； 繁殖：个体数量增多。,单细胞生物与多细胞生物生长与繁殖的差异？,幼龄菌：指代谢速度快，生长繁殖旺盛的菌体。 （对数生长期） 老龄菌：指代谢缓慢，生长繁殖能力低下的菌体 （衰老期）,显微镜直接计数,涂片染色计数,血球计数器计数,间接计数法,平板菌落计数法（活菌计数法）,液体计数法（统计学原理）, 重量法,细胞重量法：湿重与干重,细胞含氮量,DNA
2、含量,试比较各方法优缺点，适用范围？, 微生物生长量测定方法,比浊法(悬浮细胞浓度),比例计数法,已知霉菌孢子密度为8108个/ml，根据显微镜视野中比例细菌密度为1108个/ml,在计数区滴加菌液，盖上特制盖玻片，利用毛细作用让菌液充满计数区,细菌计数区面积为1mm2，划分为25个大方格，每个大方格又分为1个小格，计数区的深度为0.02mm。则每个大方格的体积是1/1250000ml，（1/25mm20.02mm）。,计数时使用油镜，一般数5个大方格的菌数后计算每个大方格的平均菌数。如图所示，大方格中有14个细菌,用每个大方格的平均菌数1250000，即为每ml菌液含菌数。,Petroff-
3、Hausser计数法,。 。,液体稀释法（MPN法）,最大可能数量表（most probable number， MPN ）,菌落形成单位 （colony-forming unit， CFU）,平板菌落计数法,滤膜法,快速计数滤纸片,TTC（氯化三苯基四氮唑，无色）TF（三苯基甲臜，红色）,比浊法（Turbidity measurement）,单细胞微生物生长繁殖规律,生长曲线（growth curve）如何获得？ 根据测定生物量的方法不同，生长曲线分有： 重量法、数量法、浓度法等。,细胞重量,生长率上升阶段：细胞适应环境后快速生长繁殖的阶段， 增代时间最短。 细胞重量迅速增加。 生长率下降阶
4、段：指生长繁殖速率下降（减缓）的阶段。 内源呼吸阶段：利用细胞内物质维持生命，细胞重量减 少。细胞代谢缓慢，趋向衰老死亡。,细胞数量法（缓慢、对数、稳定和衰亡期）,单批培养中微生物的生长曲线,迟缓期,衰亡期,稳定期,对数期,总菌数,活菌数,试分析细胞数量法曲线各阶段的特点： 缓慢期（适应期） 对数生长期 稳定期 衰亡期 单细胞微生物在分批培养中为什么出现这种生长规律变化？,缓慢期：细胞不繁殖。但酶活跃，细胞物质增多，为繁殖作准备。 指数期：所有细胞的生长繁殖速率以几何级数 （2n)的方式分裂。生长速率最快。 稳定期：新增长细胞数与死亡细胞量基本相等。生长速率减缓。 衰亡期：死细胞多于活细胞，内
5、源呼吸阶段。,接种量影响缓慢期长短与生长速率,营养物浓度的影响,培养温度的影响,关于G （世代时间）：,式中：n为繁殖代数; R为生长速率常数；, 接种量影响延缓期长短； 营养物浓度高低影响生长速率； 温度影响菌体生长速率与世代时间。 还有哪些因素（内因、外因）影响着单细胞微生物的生长速率？,连续培养,连续培养(continuous culture)，开放培养（open culture） 具体操作：细胞培养对数期后，以一定速率流入新鲜培养基，并利用溢流方式以同样流速流出培养物。容器内培养物达到动态平衡，微生物生长维持在某一对数生长期的生长速率。,连续培养与分批培养的比较,恒浊器（培养液流速不稳
6、定） 恒浊器中菌体密度较稳定，菌体以最高生长速率生长。应用上：以获得大量菌体生长相平衡的代谢产物（如乳酸、乙醇等）都可以用恒浊器进行连续发酵。 恒化器（培养液流速不变） 微生物在低于最高生长速率的条件下生长繁殖， 应用上：主要用于科学研究工作。如限定底物浓度研究微生物的生长速率等。,曲线在实践中指导意义 如菌种保藏（乳酸杆菌、解酚细菌等） 发酵工业菌扩培及发酵接种 收获微生物细胞及发酵产品 废水处理 单细胞微生物在这些应用实践中宜采用哪一阶段的生理菌？,曲线在废水处理中的指导意义 生物处理目标：降低以BOD/COD 为指标的有机物浓度，减少 N/P 物质排放量、尽量减少微生物污泥量等。 活性污
7、泥法处理废水，该控制哪一生理阶段的菌群进行处理？试分析各生长阶段处理废水特点。,指数期（生长率上升阶段） 优点：细菌代谢速度最快，净化有机物的效率最高。 缺点：菌体不易凝聚沉淀； 净化后有机物浓度不能达到 排放标准； 微生物污泥量大。,稳定期（生长率下降阶段 ） 优点：菌体沉降性能较好，处理有机物较为彻底。 缺点：污泥量较大。,衰亡期（内源呼吸阶段） 优点：有机物完全氧化，细胞沉降性能与出水水质好，污泥量小。缺点；净化效率慢，有机物质浓度低。,食料/微生物与微生物代谢速率、废水处理的关系,活性污泥法处理废水的实践应用： 高浓度有机废水快速处理到一定水质，采用生长率上升阶段的菌体进行运转。 一般
8、活性污泥法处理废水（达到排放水标准），采用菌体在生长率下降后期、衰亡期前期进行运转（即延迟曝气方式处理）。为什么？,2. 微生物的遗传变异,遗传变异概念与特性 正变：优良性状提高.如生产菌发酵周期缩短，产量提高；菌种降解物质能力增强等。 负变：应用功能下降.如生产菌发酵力退化，病原菌致病性增强，菌种降解物质能力下降。 变异株易发现：从形态、细胞结构（芽孢、荚膜等）以及生理代谢特性等方面辨别与判断。 微生物遗传保守程度：其大小由不同菌种决定。, 细菌等微生物遗传变异的物质基础 遗传物质确定过程：1928年，英国细菌学家格里菲斯（Griffth）研究两种肺炎双球菌型的毒性。,S型肺炎双球菌，有荚膜
9、。 R型肺炎双球菌，无荚膜。,1928年，Griffith进行了以下几组实验： （1）动物实验 对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活 对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡 对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡 抽取心血 分离 活的SIII菌,研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性 RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith,Griffith 转化试验示意,混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,
10、SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长 活 RII 菌长出RII菌 热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,1944年，O.T.Avery(埃弗里)等从热死的S 型肺炎双球菌中提纯了各种成分（DNA,蛋白 质，荚膜多糖等），并在离体条件下分别实验。
11、 结果发现S型肺炎双球菌的DNA具有使R型 细胞产生毒性、小白鼠死亡的能力。,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,DNA组成与构成,胸腺嘧啶thymine,核酸成
12、分：碱基 (嘧啶、嘌呤），戊糖，磷酸。,胞嘧啶cytosine,尿嘧啶uracil（存在于RNA中）,鸟嘌呤guanine,腺嘌呤Adenine,戊糖,两种戊糖: DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖为-D-核糖。,糖与碱基构成核苷 (nucleoside),糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,磷酸与核苷构成核苷酸,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷和5-磷酸-核糖核苷。,1953年，DNA的结构通过x射线观察，确 定是两条走向相反的多核苷酸链构成的双螺旋 结构。在这种结构中，A-T 、G-C之间以氢键等 方式连接。, 微
13、生物细胞中的核酸, 多数双链DNA ，少数单链DNA。少数病毒遗传物质为RNA。 原核微生物除细胞核区外，在细胞质中还存在携带少量基因的环状DNA片段（质粒）。 真核微生物的细胞核是DNA与蛋白质结合 ，存在于细胞核的染色体上。,核糖核酸（RNA）,RNA分子量比DNA小，主要负责DNA遗传信息的 传递与翻译表达等。 RNA为单链分子，根据RNA的功能，可以分为mRNA、tRNA和rRNA三种。,mRNA (信使RNA) Messenger RNA,mRNA约占总RNA的5%，不同细胞mRNA链长和分子量差异大 功能：将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核 糖核蛋白体上。 如DNA一条链上
14、的碱基：A T G C G T T C C A C 转录成mRNA的碱基： U A C G C A A G G U G 遗传密码:mRNA分子上三个碱基（三联密码）决定一个 氨基酸。,tRNA (转移RNA),约占总RNA的10-15%。 它在蛋白质生物合成中识别氨基酸的密码，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体上。 rRNA (核糖体RNA) 约占全部RNA的80%，是核糖核蛋白体的主要组成部分。 rRNA 的功能是与蛋白质生物合成相关。,基因与性状,基因：DNA分子上代表一个遗传功能的片断。 结构基因：决定蛋白质结构的DNA片断。 调节基因：控制结构基因活动的DNA片断。 操纵基因：与结构基
15、因一起，起“开关”作用。,lacZ,lacY,lacA, 性状：表观现象。,生物合成蛋白质， 以DNA为模板转录成mRNA，mRNA合成多肽或蛋白质的模板进入核糖体，后tRNA根据mRNA三联体密码的信号将氨基酸进行运送，在核糖体上完成蛋白质的合成。,细菌等微生物的变异,基因突变,基因突变（碱基置换、转换颠换）,移码突变,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,微生物基因突变的原因,自发突变:微生物自发突变频率为10-410-6。 诱发突变:用物理、化学因素使微生物遗传信息改变，从而得到新的表观现象。 常用的诱变剂：紫外线、x-射线等，亚硝酸、硫酸二乙酯、过氧化氢等化学试剂。,基因重组（Gene recombination）,基因重组（或遗传重组）：两个不同性状的个体（供体、受体）内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。 原核微生物的基因重组：转化、转导、接合、原生质体融合等。 真核微生物的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。,几个基本概念,。,转化（Transformation）,。,接合（Conjugation between different bacteria）,。,原生质体
