pcr技术在乙肝方面的应用

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1、PCR技术在乙肝方面的应用 The application of PCR technique in HBV,涿州市医院检验科 刘鹏年,Hepatitis B Virus,乙型肝炎的病原体 在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被HBV感染过。 中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8%,乙型肝炎病毒感染的现状,全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能

2、发展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。,乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 部分双链环状DNA。,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,Hepatitis B Virus,乙肝的实验室诊断,（一）生化学检查 （二）HBV血清学检查 （三）HBV DNA、基因型和变异检查,生化学检查,ALT和AST 血清胆红素 凝血酶原时间（PT）及PTA 胆碱酯酶 血清白蛋白 甲胎蛋白（AFP）,生化检测的局限性,敏感度有限 代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储备能力 关于“胆酶分离”现象,HBV血清

3、学检查,项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM 方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性) 发光免疫分析(定量),HBsAg 感染的标志 Anti-HBs 既往感染/接种疫苗 Anti-HBc IgM 急性感染标志 Anti-HBc IgG 既往或慢性感染 HBeAg 急性病毒复制，有传染性 Anti-HBe 病毒不再复制 HBV-DNA 急性病毒复制，比HBeAg更准确；主要用于监测治疗反应,血清学检测的临床意义,HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义,急性

4、或慢性感染(大三阳),+,-,+,-,+,+,+,+,乙肝后期或慢性感染(小三阳),-,-,+,+,-,-,-,潜伏期或急性乙肝早期,-,-,+,+,+,痊愈或恢复期,有免疫力,-,-,-,-,-,+,+,+,-,-,痊愈,有免疫力,疫苗接种或曾经感染过,有免疫力,血清学检测的局限性,HBV具有“检测窗口期” 假阴性结果 无法检测突变株及抗体,Symptoms,HBeAg,anti-HBe,IgG anti-HBc,IgM anti-HBc,anti-HBs,HBsAg,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,100,Acute HBV Infection with Rec

5、overy,Typical Serologic Course,Weeks after Exposure,Titre,IgM anti-HBc,IgG anti-HBc,HBsAg,Acute (6 months),HBeAg,Chronic (Years),anti-HBe,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,Years,Weeks after Exposure,Titre,Progression to Chronic HBV Infection,Typical Serologic Course,PCR技术检测HBV DNA,PCR 聚合酶链式反应于1983年由美国Ce

6、tus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。,PCR反应的特点,特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 2小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板,PCR反应过程,DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 C 30s 退火（annealing）:55 C 30s 延伸（extension）:72 C 30-60s 3个步骤作为PCR的一个循环

7、，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。,普通PCR技术的缺点,普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。 因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。,定量PCR的特点,采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。 避免了假阳性。 探针与被检DNA序列特异杂交， 增强了特异性。,定量PCR的特点,可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。 光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强了灵敏性和客观性。,HBV

8、DNA检测方法的比较,斑点杂交 PCR 定量PCR 敏感性 低 较高 高 特异性 高 稍低 高 重复性 好 稍差 好 定量范围 4 6 6 简便 较繁琐 简便 简便 安全性 好 稍差 好 设备 便宜 稍贵 昂贵 技术要求 低 高 高 检测价格 低 中 高,为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测？,HBV DNA检测的临床意义 诊断方面： HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志,HBV DNA检测的临床意义, 对HBV-M起补充作用： HBeAg()/ 抗HBe()乙型肝炎 （前C区变异） HBsAg()乙型肝炎 （

9、S区变异） 低水平感染 单项抗HBc()乙型肝炎,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,HBV DNA检测的临床意义, 疗效判断： HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 预后判断 HBV DNA水平与病情有一定的关系,HBV-M与HBV DNA关系 广东 四川 湖南 解放军 南方医院 “ 大三阳” 86.2 85.0 87.3 94.38 93.4 “小三阳” 35.1 20.3 25.6 27.3 23.8 “ 小二阳” 40.7 27.6 48.8 38.56 30.5 抗HBc 11.5 10.8 19.3 抗HBs 3.6 0 9.7 0 三抗体阳 5.0 1.1 10.

10、0 全阴 0 4.0 调查总例数 1474 2828 814 838 773 HBV DNA阳性率,HBV DNA检测的临床意义,调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。,HBV-DNA定量检测的临床应用,慢性乙肝诊断 治疗监测和疗效评价 跟踪随访 预后判断,HBV-DNA定量 慢性乙肝的诊断,HBsAg阳性六个月以上 ALT持续升高或反复升高 HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）,HBV-

11、DNA定量 慢性乙肝的治疗监测,治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA） 治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg 如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效,HBV-DNA定量 治疗后的随访,无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。,HBV拉米夫定耐药,虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象

12、使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67% 一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹,YMDD变异,YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸。如发生YMDD变异，则其中的蛋氨酸（M）突变为异亮氨酸（isoleucine，I）或缬氨酸（valine，V）形成YIDD变异株或YVDD变异株 。 YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区。,YMDD变异检测,采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义 能够准确稳

13、定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案,HBV 拉米夫定耐药突变检测原理,HBV检测 I突变检测 V突变检测,什么时候开始检测YMDD变异,拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况 治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数* 6个月 6 1（17%） 612个月 26 14（54%） 1224个月 38 26（68%） 2436个月 38 38（100%） * 各组之间两两比较均有显著差异（P0.05）。,YMDD变异株的动态变化,YMDD变异株的动态变化,YMDD检测应用方法,对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测 治疗前检测一次（约

14、有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异） 治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次,慢性乙肝的基因分型,乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为AH八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主 不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化 不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗更敏感,共价闭合环状DNA (cccDNA)检测,HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板 只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才能算真正有效 HBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标,HBV基 因 及 编 码 蛋 白,阿德福韦治疗乙型肝炎,阿德福韦为5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明显抑制HBV DNA复制 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1% HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%11%,1896突变的诊疗意义,G1896A点突变，形成终止密码子 (TAG)，不表达HBeAg； 由于e抗原不能合成，血清中检测不到HBeAg，但乙肝病毒仍处于复制状态； 此类HBeAg阴性乙肝患者更容易发生严重的肝脏疾病，需接受更为长