分子生物学2015年硕士

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1、,5.核酸的分子杂交 （southern blot/northern blot） 6.反义核酸技术(siRNA) 7.基因芯片技术,5.核酸的分子杂交 （southern blot/northern blot）,（1）变性 即打开DNA双螺旋结构，变成单链DNA的过程。 变性的方法有：加热变性 有机溶剂变性 高浓度盐变性 碱变性等 常用方法是加热变性和碱变性。 DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称 增色效应。当增色效应达到最大值的50%时温度，称熔解温度 （melting temperature Tm值），Tm值表明DNA溶液中一半的 DNA双链已解离为单链，也就是说，T

2、m值反映了DNA变性的程度 和难易，Tm值越大，变性越难，反之，变性容易。,大多数DNA的Tm值在8590左右。但Tm值并不是一个固定常数，常受许多因素影响。 DNA的碱基组成。A：T碱基对只有两个氢链，而G：C碱基对有3个氢键。因此Tm值主要受G：C碱基对数量多少的影响，有一个经验公式为： Tm(G+C)%0.4169.3 溶液的离子强度。DNA链上的磷酸基团带负电荷，它们之间的静电具有相互排斥作用，可导致DNA双链结构的不稳定，比如：在无盐的水中，DNA在室温条件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA双链的稳定性增加，Tm值亦会升高。,pH值，pH值在59之间

3、范围内，Tm值变化不明 显，即DNA双链比较稳定，在高pH值情况下，可使碱基 失去形成氢键的能力。当pH值大于11.3时，所有氢键 均被破坏，DNA完全变性。这就是碱变性的原理。 变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形 成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲。 通常用50的甲酰胺可以使Tm值降低30。,（2）复性 变性DNA的两条互补单链，或两条具有同源性的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火。,复性的（速度）过程要受到许多因素的影响。 DNA的浓度：DNA浓度直接影响到DNA单链间碰撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。 DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速度

4、较慢，碰撞机率较少，同时又很难形成正确配对，因此复性速度较慢；但一旦复性，又难于变性。 温度：温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；而温度过低，碰撞机率减少，一旦形成局部错误配对，又不易解离，难以继续寻找正确配对，因而使复性速度降低；适宜的温度是较Tm值低1525。,离子强度：离子强度过低，不利于复性。 pH值：pH值在59范围内，不影响复性速度，过低或过高则影响。 DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。,（3）杂交体系的建立要考虑以下几因素 DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越快。其方 法有：加入足够的

5、DNA；尽量减少杂交的体积，一般 以每平方厘米滤膜面积加50100l杂交液为宜。 DNA探针的长度：在杂交过程中，待测DNA固定 在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越 慢，变性越慢。因此探针的长度不宜过长，一般以1050bp（一般探针20bp）。,离子强度：离子强度对变性影响较大。一般常用5或6SSC（1SSC为0.15mol/L Nacl和0.015mol柠檬酸钠）。 温度：温度对于杂交（复性）反应的快慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的因素。 一般认为杂交温度为：68（不含甲酰胺（作用：降低Tm值）；当含50甲酰胺时，在42进行杂交。 洗膜温度一般认为5565。 对于寡核苷酸探针

6、的杂交温度，应根据下列公式推算：Tm=4G：C对数量2A：T对数量。而杂交温度一般比Tm值低5，即55。 Tm值的推算：与G：C对数量，离子强度，变性剂等有关。 杂交时间：经验杂交时间816h，过夜。,减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭，同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。采用鲑鱼精子DNA（Salmon Sperm DNA）或小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA）封闭DNA非特异位点；采用脱脂奶粉封闭DNA非特异位点外，更主要封闭膜上非特异吸附位点。 促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖(dextran sulfate,Mw 500000)能促进DN

7、A链间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子，从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应，促进杂交反应速度。如10硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提高10100倍。,预杂交；将膜放在预杂液中，即不放探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂交位点。预杂交的温度和时间一般与杂交的温度和时间是一样的。 预杂交液：5SSC； 5 Denhardt；50mmol/L PBS； 0.2%SDS；500ug变性鲑鱼精DNA；50%甲酰胺 杂交：杂交液中除含封闭物质外，还含有10硫酸葡聚糖和探针。探针如果是双链DNA，则需要进行变性处理：沸水中加热5min，然后迅速置冰浴中（防

8、止蛋白酶作用）；也可用碱变性处理。探针是寡核苷酸片段、单链DNA或RNA，则不需要进行变性处理。,（4）杂交操作步骤,将探针加到杂交液中，然后与膜上的待测核酸进行杂交反应。温度68（不含甲酰胺），42（含50甲酰胺），杂交时间：816h过夜。 洗液：洗膜过程是将膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定的温度下，非特异杂交体容易解链而被洗掉，而特异性杂交体由于稳定而保留在滤膜上。 注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温3765）。即逐渐增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为下一

9、步反应（检测）做好准备。,（5）杂交信号的检测,放射自显影：探针标记了放射性核素，如 32P、35S、125I或131I。其具体方法是：在暗盒里 将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗 盒，置70曝光一定时间。放射线可使X光片 曝光，经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点， 根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与 探针相应序列及大小。,显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在的情况下，可发生显色反应。一般情况下，大都是通过间接法结合酶。即探针标记了半抗原，如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋白的配体（avidin）结合酶，酶在有底物存在的情况下再发生显色反应。

10、即:,A B C 酶+底物 显色,探针,标记物 (地高辛),抗体,根据显色反应斑点大小判断结果。,常用的酶 碱性磷酸酶： 作用底物有：BCIP（5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸） NBT(硝基蓝四氮唑)。 显色过程：碱性磷酸酶 BCIP 脱磷，产生H+ NBT还原 紫色化合物。 辣根过氧化物酶（HRP）： 常用的底物：DAB（二氨基联苯胺） TMB（四甲基联苯胺） DAB经HRP消化产生红棕色，有致癌性。 TMB 经HRP消化产生蓝色，无致癌性。常用后者。,化学发光反应 与显色反应基本一致，只是酶（HRP碱性磷 酸酶）催化一种特殊底物如luminol、CSPD等， 产生发光，而不显色。该化学光可使

11、X光片曝光， 经显影、定影后，可获得杂交斑点。化学发光是 一种有发展前途的检测方法。如需准确定性和定 量，可用数字成像系统进行检测。,SDS-PAGE浓缩胶（5% Acrylamide）配方表,SDS-PAGE分离胶（10% Acrylamide）配方表,三种印记技术的比较,6.反义核酸技术 6.1 RNAi实验基本概念 6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计 6.3 siRNA转染过程相关问题及解答,6.1 RNAi实验基本概念,6.1.1 RNAi的概念: RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而

12、介导的转录水平基因表达抑制。 6.1.2.RNAi的启动途径: (1) dsRNA途径 (2) siRNA途径 (3) shRNA表达载体途径,(2) siRNA途径: 小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。,6.1.3.RNAi的效应表现: RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。,6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计,6.2.2 siRNA设计需要注意的问题：

13、(1) siRNA序列设计 (2) 阴性对照的作用 (3) 阳性对照的重要性 (4) siRNA荧光标记的问题,(1) siRNA的设计： 理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。 可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。 如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。,(2) 阴性对照siRNA的作用： 阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。,(3) 阳性对照siRNA的重要性： 阳性对照siRNA采用确认有

14、效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因； 用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可行等； 阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。,(4) siRNA荧光标记的问题： 采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染试剂优化转

15、染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。,6.2.3 RNAi Off-target(脱靶效应)： (1) 什么是RNAi Off-target(脱靶效应)? (2) 脱靶效应如何检测？ (3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？ (4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？ (5) 如何避免脱靶效应？,(1)什么是RNAi Off-target(脱靶效应)? 简单地说，就是siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目前已广泛引起研究者重视。,(2) 脱靶效应如何检测？ 多种方法可

16、以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片的方法。,(3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？ 以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会产生脱靶效应。,(4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？ 有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调，则会出现假阳性现象。,(5) 如何避免脱靶效应？ 脱靶效应并不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应的发生，如针对同一靶基因设计2条以上抑