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1、1脂氧合酶抑制剂 NDGA 对 HT作者：夏光涛 张源潮 武森森 张尚忠 【摘要】目的：探讨脂氧合酶抑制剂 NDGA在体外对结肠癌 HT29细胞株生长抑制、凋亡影响。方法：应用 MTT法绘制生长曲线；倒置相差显微镜观察细胞形态变化；扫描电镜观察细胞的超微结构变化，检测凋亡小体；流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期变化。结果：不同浓度 NDGA处理 HT29结肠癌细胞，随着药物浓度加大，细胞形态变圆，体积缩小，从瓶壁上逐步脱落，肿瘤细胞凋亡率逐步上升，癌细胞阻滞于 G0G1 期。应用扫描电镜可见凋亡小体形成。结论：NDGA对结肠癌 HT29细胞具有抑制生长、诱导凋亡作用，凋亡率随药物浓度加大逐步升高
2、。具有剂量依赖效应。【关键词】脂氧合酶抑制剂结直肠肿瘤凋亡Research on apoptosis of colon cancer cell line HT29 induced by NDGA【ABSTRACT】Objective:To find out the effect of NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid),the lipoxygenase inhibitor,on colon cancer cell line HT29 in vitro from the aspects of cell growth inhibition, cell apoptosi
3、s.Methods:We applied respectively. MTT to draw the growth curve. inverted phase contrast microscope to observe morphologic change of cells as well as scanning electron microscope to observe changes of cells ultramicrostructure and apoptotic body. flow cytometry to examine the apoptosis and periodic
4、changes of cells.Results:We used different concentration of NDGA to dispose cancer cell independently.Accompanying the rise in drugs concentration,apoptosis rate of cells rose gradually,morphologic of cells became round,the volume became small and they abscised from the inner surface of the bottle.a
5、poptotic body could be found through scanning electron microscope.The growth of cells was blocked in the stage of G0/G1.Conclusions:NDGA can inhibit colon cancer cell line HT29 growth and induce its apoptosis,the rate of which rises following the increase of drug concentration and displays the relyi
6、ng effect of doses.The drug blocks the cell in the stage of G0/G1.【KEY WORDS】Lipoxygenase inhibitorsColorectal neoplasms Apoptosis 花生四烯酸的代谢分为环氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX）两个途径。COX 是环氧化酶途径的关键酶。抑制 COX活性能够诱导结肠癌细胞凋亡，抑制癌细胞转移，对此国内外学者已达成共识，抑制 LOX途径能否抑制结肠癌细胞生长、诱导凋亡，目前国内外鲜有报道。本文应用 NDGA (Nordihydroguaiaretic Acid)处理 HT2
7、9结肠癌细胞株，研究是否可抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡为临床治疗提供依据。21 材料与方法1.1 仪器及设备 37CO2 恒温培养箱（NV2500E。美国） ，超净工作台（YJ1450S，苏州） ，倒置相差显微镜（Olympus，日本） ，普通光学显微镜（ Olympus，日本 BH2） ，台式高速离心机（HERMLEZK380） ，酶联免疫检测仪（BIORAD450 型） ，流式细胞仪（ FACScan型，美国 BD公司） ，JSMT300 扫描电镜（日本 JEOL公司）以及其他培养细胞常用设备。1.2 材料和试剂1.2.1 结肠癌细胞株 HT29细胞株购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。1
8、.2.2 主要试剂 RPMI1640培养液和胰蛋白酶购自 Gibco公司。新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。NDGA 购自 Calbiochem公司，四氮唑盐（MTT）购自 Sigma公司，碘化丙啶（PI）购自北京岳泰生物制品公司。1.3 细胞培养 常规培养 HT29结肠癌细胞。采用处于指数生长期的细胞进行实验，分别加入不同浓度的药物处理后，继续在 CO2恒温箱孵育相应的时间后，进行有关指标检测。1.4 细胞形态学观察1.4.1 倒置显微镜观察 细胞传代后，每隔 6h分别应用高倍镜及低倍镜观察一次 HT29结肠癌细胞的形态学变化，细胞生长情况，培养液的情况。贴壁后，每隔 4h观
9、察 1次。药物处理后每隔 2h观察 1次细胞生长情况，形态学变化。1.4.2 扫描电镜观察 应用 NDGA（终浓度 100mol/L）处理 48h。取出对照组及加药组长有癌细胞的载玻片，经 3戊二醛前固定，再应用 0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗 3次，1四氧化锇（锇酸）固定 1h，再用 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 3次，乙醇梯度脱水，醋酸异戊脂置换，CO2 临界点干燥、粘托、镀金，JSMT300 扫描电镜 15KV加速电压观察，拍照。1.5 癌细胞凋亡检测1.5.1 MTT法绘制生长曲线 实验设计为 5组：空白组（不加细胞） 、对照组（加入 PBS液） 、NDGA 组
10、（分别为 1，10，100mol/L） ，每组设 5个平行孔。将培养瓶中贴壁的结肠癌 HT29细胞应用 0.25的胰酶消化，细胞形态发生改变时，加入含有小牛血清培养液中和，吹打，制成细胞悬液，以 104ml 的浓度接种于 96孔培养板，每孔接种 200l。培养 24h后，分别加入不同浓度药物，分别继续培养 24，48，72h 后取出一块培养板检测细胞光密度（OD） 。实验方法：每孔加入新鲜配制的 MTT液（5mg/ml）20l，37，继续培养 4h，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入 DMS0150L，放置振荡器 10min，使结晶物充分溶解，3然后在酶联免疫检测仪上应用双波长(490,570n
11、m)测光密度值，以空白组 OD值调零。以时间为横轴，OD 值为纵轴绘制生长曲线。 1.5.2 流式细胞仪检测癌细胞凋亡率及细胞周期变化 分别收集对照组及 NDGA药物（100mol/L）作用 48h的 HT29结肠癌细胞。先用 0.25的胰酶消化，再用含小牛血清培养液中和，然后再加入离心管中离心，用 PBS液漂洗后再离心 5min（1000r/min） ，加入 70的冷乙醇固定，4冰箱保存过夜。以 PBS液漂洗后以 100目筛网过滤，再离心5min（1500r/min） 。加入 PI工作液 0.05ml，室温避光 30min，上机检测。上机前以标准荧光微球体调整仪器的变异系数并稳定在 2以内。
12、上机后收集 2万个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在 Macintosh650计算机上用 Modifit软件（Becton Dickinson公司提供）分析数据，由HP1200cPS 打印结果。1.6 统计学处理 定量资料数据均以 xs表示，统计计算采用 SPSS12.0统计软件进行处理，进行方差分析、t 检验、Dunnett t检验以及其他统计处理，P0.05 为有统计学意义。2 结 果2.1 NDGA作用 HT29结肠癌细胞时细胞形态学观察2.1.1 倒置显微镜进行细胞形态学观察对照组 HT29结肠癌细胞呈类圆形，部分伸展的癌细胞可呈现梭形，以贴壁方式生长。经过 NDG
13、A（100mol/L)作用24h以后，细胞开始发生形态变化，表现为细胞较前变圆，体积缩小，细胞内颗粒、空泡增多，细胞粘附性降低，有较多细胞从瓶壁脱落，悬浮于培养液中（图1B） 。随药物浓度增大，时间延长，这种变化越来越明显。2.1.2扫描电镜对细胞超微结构观察 对照组 HT29结肠癌细胞呈贴壁生长，呈类圆形，部分癌细胞伸展为梭形，细胞饱满，表面有丰富微绒毛，癌细胞之间连结紧密，表面微绒毛之间相互交叉，经过 NDGA（100mol/L)作用 48h癌细胞形成相互分隔的芽状突起，形成凋亡小体（图 2B）2.2 NDGA对 HT29结肠癌细胞诱导凋亡作用2.2.1 NDG4对 HT29结肠癌细胞生长
14、曲线的影响 对照组 HT29结肠癌细胞生长迅速，1100mol/L 浓度的 NDGA对 HT29结肠癌细胞生长均有抑制作用。1mol/L 药物作用组各个时间段分别与对照组相比，虽然 OD值有下降趋势，但与对照组相比，差异没有统计学意义（P0.05)。随着 NDGA药物浓度的增大（10，100mol/L） ，OD 值分别与对照组相比，差异有统计学意义(P0.05)，其中 100mol/L 的 NDGA作用组 OD值与对照组差异显著(P0.01)，说明 HT29结肠癌细胞受抑制的程度随药物浓度的升高而增强（见表 1，图 3） 。 表 1 NDGA对结肠癌细胞株 HT29 OD值的影响2.2.2 H
15、T29结肠癌细胞凋亡率和细胞周期变化 对照组 HT29结肠癌细胞在G0G1 前存在凋亡峰，凋亡率百分数为 1.281.07，经过 NDGA（100mol/L）4作用 48h后，凋亡峰明显升高，凋亡率百分数为 10.573.09，与对照组相比差异有统计学意义（P0.01）.G0G1 期的细胞比例增加。S 期细胞比例下降，与对照组两期差异显著(P0.01)。而 G2M 期 NDGA作用组与对照组相比差异没有统计学意义(P0.05)。说明经 NDGA作用后结肠癌 HT29细胞凋亡率增加，NDGA可使 HT29结肠癌细胞阻滞于 G0G1 期，从而抑制 HT29结肠癌细胞生长（表2，图 4）表 2 ND
16、GA对 HT29细胞凋亡率和细胞周期的影响3 讨 论花生四烯酸（AA）代谢分为环氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX）两个途径。研究发现，相对于正常组织，睾丸癌、乳腺癌、结肠癌及肺癌肿瘤组织中 LOX代谢水平明显升高，提示肿瘤的发生可能与花生四烯酸经 LOX途径代谢有关1，2，3 。花生四烯酸经脂氧合酶途径进行生化代谢，产生白三烯（leukotrience,LT)及 HETE(hydroxyeicosatetraenoic)。LOX 又可分为5LOX，12LOX 及 15LOX3种亚型，不同类别的肿瘤细胞表达不同亚型，本实验选用的 NDGA对上述 3种亚型酶均有抑制作用4国外实验已证实结肠癌细胞株 HT29具有合成 LT的能力，表明该肿瘤细胞中存在 LOX代谢途径，提示该细胞中有脂氧合酶抑制剂作用位点。对于 LOX相关肿瘤的治疗，主要有两个途径，一个途径是直接应用 LT受体拮抗剂，有学者应用 SC41930，LTB4 拮抗剂用用于结肠癌细胞，发现能够抑制其
