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1、,免疫荧光组化技术,-以荧光素为示踪剂的免疫组化技术,一、荧光的特征,荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。,二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。,1、具备用于标记抗体的荧光素条件 (1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。,(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。 (3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。 (4)结合方法简便而
2、快速，并且较稳定。,(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。 (6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。,2.荧光素的种类 (1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为520530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。,(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。,(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596600nm，
3、呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。,(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）,三、荧光抗体的质量控制 主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1.特异性染色效价测定 2.非特异性染色测定 3.吸收试验 4.F/P比值的测定方法,四、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。,(2)适当稀释荧
4、光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37温育1h，PBS洗33min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检,2.间接法 是直接法的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。,五、荧光显微镜检查方法 1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。,(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激发一般荧光
5、染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过515min，球内气压升至5070标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。,(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。,2.标本制作要求 (1)载玻片厚度应在0.61.2mm之间 (2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。,(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的
6、亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。,荧光信号增强封片剂 聚乙烯醇40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml,上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20中。,3.使用荧光显微镜注意事项 (1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。 (4)检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。,(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。,(6)标本染色后应立即观察。 (7)荧光高度的判断标准，分四级“ ”为阴性，“ ”为仅能见明确可见的荧光；“ ”为可见有明亮的荧光；“ ”为可见耀眼的荧光。,六、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.先用非免疫血清处理切片，再行荧光染色 2.选用高特异性、高效价荧光抗体 3.选择合适的抗体稀释度和切片 4.漂洗彻底,
