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1、ICS65.020.30B 43DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/T XXXXXXXXX水牛胚胎冷冻保存技术操作规程 Manipulation procedures for cryopreservation of embryos in buffalo XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/T XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语与定义14试剂、耗材、设备和实验室要求25冷冻胚胎的选择和标记26冷冻载体的准备37胚胎的冷冻38贮存与运输49胚胎的解冻4附录A（规范性附录）试剂、耗材和设备5附录B
2、（规范性附录）胚胎冷冻和解冻液体7附录C（规范性附录）胚胎冷冻和解冻记录表8前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。本标准主要起草人：杨春艳、尚江华、郑海英、梁贤威、鄢胜飞、李孟琪、黄芬香、于农淇。8水牛胚胎冷冻保存技术操作规程1 范围本标准规定了水牛胚胎超低温冷冻技术规程，包括程序化冷冻和玻璃化冷冻技术要求。本规程适用于水牛胚胎超低温冷冻技术推广应用的规范化操作。本规程特指体内胚胎和通过体外受精、单精子胞质内显微受精、体细胞核移植技术生产的胚胎。2 规范性
3、引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5458 液氮生物容器GB/T 25881 牛胚胎标准 第4部分：牛胚胎发育阶段划分和牛胚胎分级评定3 术语与定义下列术语和定义适用于本标准。3.1超低温保存 cryopreservation经特殊方法处理的胚胎放置在196（液氮）的超低温度中，使其新陈代谢暂时停止，从而将胚胎进行长期保存。3.2体内胚胎 in vivo embryos通过激素促进母畜超数排卵，而后采用自然交配或人工授精，从母畜的输卵管或子宫角内回收发育
4、到一定时期的早期胚胎。3.3水牛胚胎体外生产技术in vitro production, IVP指模拟水牛体内环境，在体外人工控制条件下，通过采集水牛卵巢上未成熟的卵母细胞经体外成熟培养、精子体外获能、精卵体外受精和受精卵胚胎体外培养等技术生产胚胎。3.4体外受精 in vitro fertilization, IVF模拟体内环境使哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称为试管动物 (test-tube animal)。3.5胞浆内单精子注射技术intracytoplasmic sperm injection, ICSI借
5、助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精，并在体外发育成胚胎的技术。3.6体细胞核移植 somatic cell nuclear transfer, SCNT将一个动物的体细胞核移入去核的成熟卵母细胞中，产生与供体动物遗传成份基本一致的动物后代技术。4 试剂、耗材、设备和实验室要求4.1 试剂所用试剂、药品以及要求见附录A.1。4.2 耗材所用耗材见附录A.2。4.3 设备所用主要设备见附录A.3。4.4 实验室要求工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室等组成。其中，缓冲间面积不得小于3平米，要求安置更衣柜和紫外灯，紫外灯强度不得低于1.5W/m3。紫外灯管距地面距离不应超过2.5 m
6、，每次照射时间为2030 min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级，操作区应达到百级。5 冷冻胚胎的选择和标记5.1 各胚胎发育阶段和质量等级的标记胚胎发育阶段划分和胚胎分级评定应符合GB/T 25881规定。但由于水牛胚胎的发育时间相较于牛快，因此所有水牛胚胎发育阶段应提前12 h。而且胚胎产品冷冻前后的质量应达到B级（含B级）以上。桑椹胚（ML）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（BL）、扩张囊胚（EXB）、孵化囊胚(HB)的缩写需统一规范。5.2 不同种类胚胎的标记体内胚胎标记为IVE，体外受精胚标记为IVF，胞质内单精子显微注射胚胎标记为ICSI，体细胞核移植胚胎标记为SC
7、NT。5.3 胚胎标记范本细管上标记的胚胎信息含冷冻时间、胚胎种类、胚胎个数、发育阶段、质量。如2017年7月20日冷冻2枚A级IVF扩张囊胚，其登记的序号为101，则标记为170720 IVF 2EXB A 101。而如果是当天冷冻两枚A级体细胞核移植扩张胚胎，其细胞供体牛的序号为4001，则标记为170720 SCNT 2EXB A 4001。同时做好详尽的胚胎冷冻表格，注明胚胎所有的相关信息，胚胎信息登记表见附录C。6 冷冻载体的准备6.1 程序化细管的准备程序化冷冻细管材料应无毒、耐低温，细管规格以0.25 mL为宜，细管外观正常、无变形、无裂痕，封口严密。6.2 玻璃化冷冻载体的准备
8、可以采用商业化的玻璃化冷冻载体；也可以采用0.25 mL细管，用刀片将其一端斜切，形成一截斜切面，以此切面作为玻璃化冷冻的载体。7 胚胎的冷冻7.1 胚胎的程序化冷冻7.1.1 胚胎的洗涤冷冻前将A级、B级胚胎置于胚胎培养液中洗涤23次。7.1.2 胚胎的平衡程序化胚胎冷冻液的成分见附录B。将洗涤后的胚胎放入冷冻液中，室温下平衡1520 min。7.1.3 胚胎的装管将平衡后的胚胎装入0.25 mL细管中，装管顺序为：冷冻液（约3 cm）气泡（约0.5 cm）冷冻液加胚胎（约7 cm）气泡（约0.5 cm）冷冻液（约2 cm），而后用封口粉沾水封口。每支细管可装1-4枚发育状况相同的胚胎。7.
9、1.4 冷冻程序将装好的冷冻管装入加好液氮的程序降温仪内，棉塞一头朝上或者朝外，而后以4/min的速率降至-7，用镊子缠好灭菌棉，浸入液氮，迅速接触细管棉塞和冷冻液的交界面进行植冰。植冰后在-7平衡5 min，以0.3/min的降温速率降至-36后，直接将细管投入液氮内。7.2 胚胎的玻璃化冷冻7.2.1 液氮的准备取一保温壶，将液氮加至其容量的约三分之二处，盖好后提至工作台内备用。7.2.2 冷冻平衡液和冷冻液的准备 取一塑料平皿，各加入3滴100 L冷冻平衡液，3滴100 L冷冻液，室温下平衡510 min。7.2.3 冷冻胚胎的平衡将胚胎用胚胎培养液清洗23次后，转至平衡液滴内清洗2次，
10、最后转入第三滴平衡液内在室温下保持5 min。7.2.4 玻璃化冷冻步骤平衡后的胚胎用胚胎冷冻液清洗两次，而后吸取胚胎和少量的冷冻液（尽量少于1 L），在体视显微镜下放置在冷冻载体的截面上，如果冷冻液过多可吸除部分冷冻液。而后将带有胚胎的一端浸入液氮，保持3 s，再将整个载体浸没入液氮。8 贮存与运输8.1 贮存冻胚和液氮的生物容器均不可叠放。用液氮生物容器贮存时，细管应完全浸没到液氮中。液氮容器应符合GB/T 5458的规定。8.2 移动液氮生物容器时，应轻拿轻放，防止冲撞、震动和倾倒。8.3 冻胚运输时，应有专人负责，途中应及时检查和补充液氮。运输过程中注意防挤压、防冻、防雨淋、防晒、通风
11、散热。9 胚胎的解冻9.1 程序化冷冻胚胎的解冻9.1.1 解冻液的准备 程序化冷冻胚胎的解冻液为常规的胚胎培养液，在胚胎解冻前2 h将胚胎培养液作100 L微滴，并覆盖石蜡油，放入培养箱平衡备用。9.1.2 细管的解冻将胚胎细管空气浴10 s后置于35-37水浴中，浸浴约30 s至胚胎冷冻细管彻底溶化。用消毒卫生纸擦干细管，剪去封口端，将胚胎推入培养皿中；在体视显微镜下挑取胚胎。胚胎培养液清洗三次以后，转入微滴内培养复苏。9.2 玻璃化冷冻胚胎的解冻将玻璃化胚胎解冻液在培养皿上作约四个100 L微滴。解冻时液氮内取出冷冻管，空气中晃动3 s，将带有胚胎的一端放入微滴内轻轻晃动，在体视显微镜下
12、见胚胎脱出，而后将胚胎取出用解冻液快速清洗三次后，放入解冻液内停留5 min，而后再用胚胎培养液清洗三次，转入微滴内培养复苏。9.3 胚胎的复苏检测胚胎解冻后在体视显微镜下观察，解冻后的胚胎发育阶段和质量应符合GB/T 25881规定，胚胎解冻信息详见附录C。AA附录A （规范性附录）试剂、耗材和设备A.1 主要试剂及要求A.1.1 试剂名称乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、TCM 199、胎牛血清（FBS）、牛血清白蛋白（BSA）。A.1.2 试剂要求所用的试剂除特殊规定外，均为分析纯及其以上纯度的化学试剂，符合组织细胞培养要求。TCM 199、胎牛血清等推荐选用胚胎培养
13、测试的产品。A.1.3 胚胎体外培养液推荐使用TCM199（含25 mM HEPES和0.26 mM NaHCO3）+10% FBS。A.1.4 血清的灭活处理新购的胎牛血清，已注明灭活处理的，用0.45 m滤器过滤灭菌后，可以直接使用；未注明灭活处理的，需56 水浴灭活30 min，用0.45 m滤器过滤灭菌后使用。血清经灭活及过滤灭菌后，分装并于-20 或-80 超低温冰箱中长期保存备用。A.2 主要耗材玻璃培养皿：f 20 mm塑料培养皿（perti dish）：f 35 mm、f 60 mm滤器：f 0.22 m、f 0.45 m加样器枪头（2 L，20 L，200 L，1000 L）
14、加样器枪头盒（2 L，20 L，200 L，1000 L）0.25 mL塑料胚胎麦管胚胎吸管玻璃细管：f 5 mm透明硅胶软管脱脂棉纱布封口膜标签纸记号笔一次性乳胶或PE手套A.3 主要设备 体视显微镜CO2培养箱冰箱或冰柜超净工作台恒温热台低温冰箱电子分析天平（至少精确到0.01 mg）加样器（2 L，20 L，200 L，1000 L）超纯水仪电热恒温水浴锅液氮生物容器酒精灯BB附录B （规范性附录）胚胎冷冻和解冻液体B.1 程序化冷冻液配方为TCM199+0.05 M 海藻糖+1.8M 乙二醇+0.4% BSA。取18 mL的TCM199，加入0.378 g海藻糖、2 mL乙二醇、0.08 g BSA，用枪头或者吸管吹吸充分混匀，而后用0.22 m滤器过滤入无菌容器内，置于4冰箱冷藏保存。B.2 玻璃化冷冻平衡液配方为TCM199+10% FBS+20% EG+5% DMSO。采用TCM199添加10% FBS作为基础液。取7.5 mL基础液加入2 mL DMSO（二甲基亚砜）和0.5 mL的EG（乙二醇），用枪头或者吸管吹吸充分混匀，而后用0.22 m滤器过滤入无菌容器内，置于冰箱冷藏保存。B.3 玻璃化冷冻胚胎冷冻保存液配方为TCM199+10% FBS+20% EG+20% DMSO+0.05 M蔗糖。采用TCM199添加10%FBS作为基础液。取6 mL
