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1、淋巴瘤病理规范化诊断专家共识 李小秋 汝昆 陈刚 林素暇 周小鸽 高子芬 刘卫平 姜文奇 朱雄增 恶性淋巴瘤（以下称“淋巴瘤”）是一组B、T或NK细胞起源、类型复杂的肿瘤总称，广义的淋巴组织肿瘤还包括组织细胞和树突细胞来源的肿瘤。近年来，淋巴瘤临床诊治与基础研究均取得了长足的进步，推动着淋巴瘤病理分类不断向前演进，也对淋巴瘤的病理诊断提出了更高的要求。为了更好适应淋巴瘤现代诊疗模式的需求，促进国内不同层次的病理科对淋巴瘤诊断水平的提高，本文作者于2013年11月9日和2014年2月22日先后两次召开会议，探讨适合我国国情的淋巴病理诊断相关流程与规范，现将与会专家达成的共识总结如下。 一、淋巴瘤
2、病理诊断总则 目前，淋巴瘤的类型区分和诊断标准主要是依据世界卫生组织（WHO）制定的造血和淋巴组织肿瘤分类。WHO分类认为不同类型或亚型的淋巴瘤在其形态、免疫表型、遗传学以及临床表现等方面各自具备独特的特征。对这些疾病的识别，因此也应建立于对上述参数全面评估、综合判断的基础之上。淋巴瘤病理诊断整合了组织形态、免疫组织化学染色、流式细胞分析、细胞遗传学以及分子生物学等多种辅助检测技术。当前，对于绝大部分病例而言，经典的组织病理学检查仍然是诊断淋巴瘤最主要的方法，而免疫组织化学染色则是判断肿瘤免疫表型以及检测部分遗传学异常的重要手段。所以，几乎所有淋巴瘤病例均需接受包括免疫组化在内的组织病理学检查
3、之后方能确诊，部分病例的诊断和鉴别，还需辅以其他必要的检测技术。 淋巴瘤首次病理诊断必须依据切除或切取活检所获得的组织标本做出。一般而言，细针吸取细胞学检查不宜作为淋巴瘤确诊（特别是首诊）和分型的可靠依据，但可用于淋巴瘤疑似病例的初筛以及确诊病例的其他可疑受累灶或复发病变的确认，在某些特定情形下（例如：白血病等非实体性肿瘤、体液标本或获得病变组织较为困难时），细胞学检查亦可用于疾病诊断，但通常需辅以细胞块制作、免疫组化、流式细胞或细胞遗传学分析等辅助检查。 独特的临床特点也是某些类型淋巴瘤确诊的重要依据，因此，申请病理检查的临床医师有义务通过填写病理检查申请单向病理医师提供必要的信息：包括患者
4、的年龄、性别、活检部位等一般信息以及临床表现、影像学、内镜和其他实验室检查的主要阳性发现、既往病理检查记录等。病理医师亦可通过查阅电子病历、直接与相关临床医师沟通或参加淋巴瘤病例临床多学科讨论等多种形式获得相关信息。 二、标本获得、组织处理与切片制作 足量、合格的诊断性组织是对淋巴瘤进行形态观察以及开展免疫表型和遗传学研究的物质基础。标本获得、组织处理和切片制作等环节也因此直接影响到淋巴瘤病理诊断的准确性。对于那些不适合做组织学评估（例如：严重的器械性损伤或大量坏死而导致诊断性组织过少）的标本，应建议重复活检。组织学标本根据其获得途径又可分为切除活检标本以及切取活检（包括钳取、空芯针穿刺等）标
5、本等。淋巴结、脾或某些结外病灶的完整切除标本，有助于病理医师对整个病变进行全面评估，且可保证有足量的组织用于辅助检查，是诊断淋巴瘤最为理想的标本。如有多个解剖区域的淋巴结病灶，一般宜选择颈部病灶。手术时应注意选择最有代表性（肿胀明显且不伴严重变性、坏死，必要时可通过冷冻切片检查予以确认）的淋巴结予以完整切除。手术动作宜轻柔，尽可能避免组织因牵拉、钳夹等造成机械性损伤。对于难以完整切除的病灶，可通过开放手术、内镜活检或空芯针穿刺等方法获得小块组织样本供病理学检查，多数也能满足诊断需要，缺点是有时不能获得数量充足或质量满意的诊断性组织而需要重复活检。空芯针穿刺也是骨髓以及胸、腹腔等深部病灶活检最常
6、用的方法。 原则上，所有淋巴结或体积较大的淋巴瘤组织标本均应在新鲜、湿润状态下尽快送到病理科进行处理，不能及时送检的标本亦可短暂放置4冰箱保存。病理科在接收标本后应予尽快处理。较大的淋巴结标本应垂直其长轴作平行切分（每片组织厚度23mm）并作印片检查，小于1cm的淋巴结可按淋巴结长轴的最大径切开。印片检查提示为淋巴瘤的病例，应选择12片最大的组织片以厚滤纸作双面衬裱后置于包埋盒中，再浸于足量固定液中固定。固定液应选用4%中性甲醛溶液，固定时间通常为1224小时。剩余的组织则分别用于组织库存档、流式细胞分析、细胞遗传学检查、电镜检查、病原微生物检测等。对于非淋巴瘤或疑似感染性病变的标本，应尽快将
7、所有组织固定。对于脾脏标本，巨检时应称重并测量体积，多作切面并仔细寻找病灶所在。对于体积较小的切取、钳取或穿刺活检标本，应先固定再送病理科检查，且应将所有组织包埋、制片观察。对于骨髓活检标本，还应事先进行脱钙处理。标本组织在固定后还需进行脱水、透明、浸蜡、包埋等程序化加工才能制作切片，上述组织处理步骤目前多在自动组织处理仪中完成。 高质量的常规苏木精-伊红（HE）染色切片是淋巴瘤病理诊断的重要依据。实践中，相当部分病例的诊断困难是因为制片质量不佳所导致。HE染色切片质量优劣与否，取决于组织处理、切片、染色、封固等诸多技术环节的质量控制。其中，及时而充分的固定、浸蜡前彻底脱水以及封片前透明这些步
8、骤尤为关键。切片厚度以2-4m为宜。 三、组织学检查与形态分析 基于HE染色切片的组织形态分析尤为重要。一方面，特征性的形态改变本身就对某些类型淋巴瘤的诊断有着决定性的提示作用；另一方面，相当多的辅助检查（例如：免疫表型分析、分子遗传学检测等）都必须在形态分析的基础上合理选择和使用。不但如此，这些辅助检查的结果，也只有结合形态正确解读才具有诊断价值。实践证明，形态分析作为一种经典的诊断方法，不但能为淋巴瘤的诊断提供丰富而又可靠的循证医学证据，而且也是通往正确诊断的捷径。淋巴瘤种类繁多、形态多样，不同专家对于淋巴瘤形态分析的思路与技巧也各有独到之处。概括而言，淋巴瘤形态分析的基本原则和其他实体肿
9、瘤相似，不外乎从肿瘤细胞的生长方式、肿瘤细胞的形态以及间质反应这几个方面对肿瘤的特点予以观察、比较和总结。恶性肿瘤一些共同特性，例如瘤细胞的异型性和破坏性生长等，在各种淋巴瘤中也有相应的表现，而且是淋巴瘤和反应性病变鉴别的重要依据。淋巴瘤按肿瘤细胞的分布特点可分为弥漫性、滤泡/结节性、副皮质性、窦性等不同生长方式。不同形式的生长方式可单独或组合存在，导致淋巴组织正常结构部分或完全破坏。淋巴瘤肿瘤细胞的构成和形态多样，按照细胞大小和细胞丰富程度可大致归纳为小细胞为主、弥漫大细胞性、散在大细胞性、弥漫中等大细胞以及大小不同细胞混合性增生等多种类型。除了肿瘤细胞，相当一部分淋巴瘤病灶中还常混杂有数量
10、不等的反应性细胞（例如：小淋巴细胞、浆细胞、免疫母细胞、组织细胞、粒细胞、树突细胞等）和血管成分。此外，某些特征性的间质改变（例如：纤维胶原组织增生、间质淀粉样物质沉积等）也有助于特定类型淋巴瘤的识别。 术中冷冻切片检查由于制片假象等诸多因素影响，通常不适合、也不足以对淋巴瘤做出明确诊断，但对于初步区分淋巴瘤与非淋巴造血组织肿瘤仍具有一定价值。对于疑似淋巴瘤的病例，应建议临床提供足量标本组织以确保常规检查。此外，通过冷冻切片检查还能及早发现标本组织有严重变性、坏死、钙化等可能会影响诊断的因素，从而确保术中送检的标本组织适合常规病理检查并足以做出明确诊断。淋巴瘤印片检查是组织切片检查的有益补充，
11、以其方法简便、操作快捷而常被用于淋巴瘤的快速筛查。 四、常用辅助诊断检查技术 （一）免疫组织化学检查 1、免疫组化在淋巴瘤诊治中的作用 免疫组化是一种利用抗原、抗体特异性结合反应来检测组织中有无特定抗原表达的组织化学染色方法。在现代淋巴瘤病理诊断中，免疫组化作为一种不可或缺的重要辅助检查技术，其作用主要体现在以下几个方面：（1）通过细胞系标志物检测来帮助判断肿瘤细胞类型（例如：B细胞或T细胞淋巴瘤）；（2）通过肿瘤细胞的免疫表型分析并结合形态学来判断细胞所处的发育阶段，从而确定肿瘤的具体类型；（3）检测肿瘤独特的遗传学改变所导致的蛋白异常高表达；（4）对鉴别淋巴瘤与反应性淋巴组织增生也有一定帮
12、助。（5）病原微生物检测。除了用于诊断，免疫组化检查对于指导淋巴瘤分子靶向治疗（例如：抗CD20、抗ALK单抗的应用）、预后判断以及微小病变的监测也具有极其重要的意义。 2、应用免疫组化诊断淋巴瘤应注意的事项 免疫组化检查首先应确保染色质量。各种因人为错误或技术、仪器原因所产生的假阴性、假阳性或欠理想的染色结果往往会导致诊断困难甚至误诊，所以一定要从组织处理、制片、抗原修复、抗体选择、染色程序等诸多环节加强监控，并通过设置合理的阴性与阳性对照作平行染色，以确保染色质量稳定保持在较高水平。其次，要熟悉各类淋巴瘤组织学形态和免疫表型，在形态分析基础上，有所针对地选择必要的抗体组合来证实诊断或帮助鉴
13、别，而不应使用数量庞大的抗体组合进行不必要的过度检测。最后，应学会正确判读免疫组化染色结果，这就要求病理医师做到：（1）熟悉各种抗体的预期染色结果，并通过适当内、外对照来判断染色成功与否；（2）在形态分析基础上正确判断何种细胞成分表达何种抗原（例如：不能把某些反应性病变中CD30+的转化大淋巴细胞或CD15+的组织细胞误认为霍奇金淋巴瘤中的H/RS细胞）；（3）熟悉各种抗体的反应谱系和适用范围，避免片面或错误解读阳性结果（例如：CD15+的异型大淋巴细胞，除了H/RS细胞之外，还可以是感染巨细胞病毒的淋巴细胞或者某些肿瘤性T细胞）。 3、淋巴瘤免疫组化检查常用标志物 用于淋巴瘤石蜡包埋组织免疫
14、组化检测的常用标志物包括以下几个大类：（1）白细胞共同抗原：CD45RB/LCA；（2）B细胞相关标志物：CD20、CD79a、CD19、PAX5、Oct-2、Bob.1、 、IgG、IgG4、IgM、IgA、IgD、CD38、CD138、CD23等；（3）T细胞/NK细胞相关标志物：CD3、CD2、CD5、CD7、CD4、CD8、CD43、CD45RO、CD56、CD57、细胞毒性分子（包括TIA-1、颗粒酶B、穿孔素）、T细胞受体蛋白（例如：F1、TCR?）等；（4）淋巴细胞活化/分化相关标志物：CD30、TdT、CD99、CD10、BCL6、MUM1等；（5）肿瘤基因和增殖相关标志物：A
15、LK1、BCL2、BCL10、cyclin D1、C-MYC、P53、Ki-67等；（6）组织细胞、树突细胞相关标志物：CD68（KP1、PGM1）、CD163、溶菌酶、CD21、CD35、S-100、CD1a、CD207/langerin等；（7）髓系相关标志物：髓过氧化物酶（MPO）、CD15、CD123、CD117、血型蛋白A、CD61、第8因子等；（8）微生物标志物：EB病毒潜伏膜蛋白1（EBV-LMP1）、人类疱疹病毒8型（HHV8）、巨细胞病毒（CMV）等；（9）其他，例如EMA、细胞角蛋白、CXCL13等。 4、淋巴瘤免疫组化检查抗体组合的选择 （1）对于需做免疫组化检查的淋巴组
16、织增生性病变而言，几乎所有病例都需要检测CD20、CD3和Ki-67这三个指标。三者联合使用通常能够很好突显淋巴组织的免疫结构，有助于良恶性病变的鉴别，并能提示淋巴瘤的细胞系起源（B细胞或T/NK细胞）； （2）淋巴细胞显示异常免疫表型（例如：小B细胞表达CD5或cyclin D1、T细胞丢失部分全T抗原、生发中心B细胞表达BCL2、淋巴细胞表达ALK、外周淋巴细胞表达TdT等）或淋巴细胞亚群构成异常（例如：富含浆细胞的病变显示免疫球蛋白轻链限制性表达等）对于淋巴瘤的诊断也很有帮助；（3）对于呈结节状生长模式的病变，可选择BCL6、CD21、Ki-67等指标来显示结节和淋巴滤泡的关系；（4）对于疑似小B细胞肿瘤类的病变（常见类型有低级别滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤等），可选用CD10、BCL6、CD5、CD23和cyclin D1这一组指标予以
