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1、1特异性抗细胞表面分子单链抗体的分离和鉴定作者：许静 吴立华 徐洁 刘俊霞 孟磊 何一心 宋增璇 【摘要】 目的：从抗 KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离和鉴定抗造血干/祖细胞表面分子单链抗体（scFv） ，克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法：用完整的 KG1a细胞吸附法富集文库 3轮，再用 CD44单克隆抗体为引导分子进行引导选择，分离单克隆后用间接免疫荧光法鉴别其细胞结合特异性。对具有不同细胞结合特异性的克隆进行 DNA序列分析，用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹鉴别抗原分子量。结果：间接免疫荧光结果显示，64 个阳性克隆分别识别不同的细胞系，分属 3种细胞结合谱，DNA
2、 序列测定结果证明C95、H1 两个克隆具有独特的一级结构，利用 Western blot成功测定它们特异性识别 KG1a细胞膜蛋白的表观分子量分别为 34 kD/22 kD。结论：成功建立了分离和鉴定抗细胞表面分子 phagescFv 单克隆的方法，并从抗 KG1a细胞的噬菌体展示文库中分离出 2个抗造血干/祖细胞的特异性克隆。 【关键词】 噬菌体展示 引导选择 表面分子 单链抗体Isolation and identification of specific single chain antibodies against cell surface moleculesAbstractObje
3、ctive:Isolation and identification of single chain antibodies against surface molecules of hematopoietic progenitor cells via phage display antibody library.Methods:An individual KG1a+ phagescFv library for the binding specificity to eight hematopoietic progenitor cell lines by indirect immunofluror
4、escein were identified. Then,the monoclonality of the scFvs was proved by testing specific binding to antigen proteins by Western blot.Results:64 KG1a+ phagescFvs were identified. They showed three kinds of cell binding repertoire. The unique primary structures of two phagescFv clones were proved by
5、 DNA sequence. Their recombinant scFvSA fusion proteins bound to the single band of proteins from KG1a cells with molecular weights of 34 kD and 22 kD,respectively.Conclusion:Reliable methods to identify phagescFv clones against cell surface molecules have been established and obtained two unique ph
6、age-scFv clones against hematopoietic progenitor cell surface molecules from an antiKG1a cell phagescFv library.Key wordsPhage display;Pathfinder selection;Surface molecule;ScFv免疫球蛋白的可变区是抗体识别和结合抗原的功能区，其分子量只有全抗体的 1/5左右，由于分子量小、组织穿透力强，因此由抗体可变区构成的单链抗体2（Single chain antibody fragments, scFv）具有体内良好的应用前景，也
7、是构建成各种双功能抗体的基本单位1。近年快速发展的噬菌体表面展示抗体技术日益成为制备单克隆抗体的有效手段，如何从包含众多非特异性和未知特异性的文库中分离特异性单克隆 phagescFv ，涉及到筛选策略选择和多项技术的应用。本研究的目的在于寻找新的有功能的抗造血干/祖细胞表面分子的抗体，并通过所获得的抗体分离抗原分子及其基因，我们探索了从自建的噬菌体抗体库中分离和鉴定特异性单克隆 phagescFv 的方法，对分离的特异性单克隆 scFv进行表达鉴定，这对于进一步研究抗造血/干祖细胞表面分子和发现新的细胞表面分子具有一定的意义2。1 材料与方法1.1 材料抗 KG1a细胞噬菌体展示文库由本室构
8、建3；NHS 生物素和链霉亲和素磁珠购自 Pierce公司；抗 M13单抗购自 pharmacia公司；抗 CD44单抗和兔抗小鼠IgGFITC 购自协和干细胞公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 F(ab)2HRPF(ab)2 购自 Protos Immunoresearch公司；表达载体 pSTE2、辅助噬菌体 M13KO7和 E.coli XL1Blue 由德国海德堡大学 Dubel博士惠赠；HL60、U937、CEM、Jurkat、NALM6、BJAB、HEL、Meg01 等细胞系由本室保存备用；限制性内切酶、连接酶等购自 Invitrogen公司。1.2 phagescFv 文库的富集
9、和引导选择参见文献4，经 KG1a细胞富集 3轮的抗 KG1a细胞噬菌体文库，用抗 CD44单克隆抗体作引导选择，分离单克隆 phagescFv ，再分别与 KG1a细胞反应。1.3 抗 KG1a细胞阳性 phagescFv 的鉴定用间接免疫荧光法，1105 KG1a细胞与单克隆 phagescFv 结合于室温 1小时后与抗 M13单抗结合 30分钟,再与荧光标记二抗 IgGFITC 结合 30分钟,每次与抗体反应均用 PBS洗 3次。在荧光显微镜下观察，使 KG1a细胞表面显示点状荧光者判定为 KG1a阳性克隆。1.4 单克隆 scFv的细胞结合特异性分析用间接免疫荧光法，全部 KG1a+p
10、hagescFv 单克隆分别与HL60、U937、CEM、Jurkat、NALM6、BJAB、HEL、Meg01 等细胞系反应，按上述步骤和判别方法鉴定 KG1a+phagescFv 克隆与上述细胞结合谱。1.5 DNA序列测定从 KG1a+phagescFv 单克隆中挑选细胞结合谱不同的单克隆送博雅公司作DNA序列测定。31.6 单克隆 scFv与链霉亲和素（Corestreptavidin, SA）融合蛋白的制备从单克隆 phagescFv 质粒 DNA中分离 scFv基因片段，插入表达载体pSTE2的 NcoI/NotI切点，转化 E.coli XL1blue, 挑选经鉴定插入正确的单克
11、隆用 IPTG诱导表达 scFvSA ，按文献5纯化 scFvSA 融合蛋白，用于免疫印迹分析。1.7 免疫印迹分析取对数生长期 KG1a细胞，提取细胞膜蛋白（以每 107细胞加裂解液缓冲液：含 0.5% TritonX100 的 PBS溶液，裂解细胞 5分钟,12 000 r/min离心 15分钟,取上清） ，行 12%SDSPAGE, 上样量为 5106细胞/孔，电泳结束后，电转移到 PVDF膜上,用 10%脱脂奶 PBST( 含 0.05%Tween20的 PBS)封闭 2小时, PBST 洗 3次，分别用单克隆 scFvSA 纯化蛋白与膜孵育 2小时，PBST 洗 6次后，用 DAB显
12、色，分析其所识别抗原的分子量。2 结果2.1 KG1a+ phagescFv 的分离效率用 KG1a细胞作 3轮富集和用抗 CD44单抗作引导选择后，随机挑取 144个phagescFv 的单菌落，表达单克隆 phagescFv ，间接免疫荧光反应结果显示64个单克隆 phagescFv 与 KG1a细胞呈阳性反应，阳性率为 44.4%，在荧光显微镜下阳性反应细胞表面有明确的点状荧光（图 1） ，阴性反应细胞无荧光。2.2 KG1a+ phagescFv 单克隆对其他细胞系的识别64个阳性单克隆分别与 8个造血祖细胞阶段细胞系做间接免疫荧光反应，其中 41个单克隆与 8个细胞系均呈阳性反应，1
13、5 个单克隆识别 7个细胞系而不识别 BJAB细胞系，8 个单克隆与 8个细胞系均呈阴性反应（表 1） 。结果显示有3种类型 scFv，它们的细胞结合谱为 9（+） 、8（+）1（-）和 1（+）8（-） 。表1 phagescFv 的细胞结合谱（略）2.3 phagescFv 单克隆的 DNA序列分析从与细胞结合谱不同的 phagescFv 中分别挑取 2个克隆作 DNA序列测定。测序结果按 Kabat编号标明 scFv核苷酸排列顺序及其演绎的氨基酸残基排列顺序，比较各个 scFv的互补决定区（CDR）6。结果 3个克隆的 DNA序列与以前报导的 C4、C131 和 C193相同；1 个克隆
14、的互补决定区与以前报导的 C194相差2个氨基酸残基；2 个克隆 C95、H1 的 DNA序列完全不同于以前报导（表 2，3）44。表 2 scFv克隆的重链互补决定区氨基酸残基序列（略）表 3 scFv克隆的轻链互补决定区氨基酸残基序列（略）2.4 免疫印迹结果分析免疫印迹结果显示 scFvSAC95 和 scFvSAH1 融合蛋白能识别和结合KG1a细胞膜蛋白中的抗原带，它们的表观分子量分别约为 34、22 kD（图 2） 。3 讨论细胞表面分子是鉴别细胞种类及其发育阶段的标志，也有一些是调控细胞行为的信号途径端口。近年来，在细胞表面分子的发现及其信号途径和调控分子应用方面都有长足的进展，
15、尤其在干细胞领域，细胞表面分子已逐渐成为预测细胞分化潜力的依据。但是由于细胞表面分子的多样性，遗传和突变造成的疾病相关分子的瞬时表达等原因，使细胞表面分子领域的研究存在很大的探索空间。人们期待新的细胞表面分子标志来鉴别各种不同发育阶段的干/祖细胞用于移植，也期待新的调控细胞行为的生物分子或药物用于临床治疗。发现细胞表面分子的经典方法依赖抗体，30 年来用杂交瘤技术制备的单克隆抗体在细胞表面分子的研究中发挥了巨大作用，至今仍在使用。但是一些表达水平很低的细胞表面分子，在细胞表面的浓度很低，很难用杂交瘤技术获得其相应的单克隆抗体，但它引发的抗体基因存在于免疫的脾细胞中，可以用基因重组和噬菌体表面展
16、示技术获得其单克隆单链抗体。我们已采用这项技术成功构建了抗 KG1a细胞单链抗体库3。KG1a 细胞分化程度很低，具有造血干细胞特征，其表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子及细胞因子受体或与干细胞迁移和归巢有关的粘附分子，本研究用 KG1a细胞吸附富集抗 KG1a细胞表面分子噬菌体库后再用 CD44单抗作引导选择，使 KG1a+phagescFv 达到44.4%，与我们以前报道的结果近似，说明这种分离方法高效且稳定4。本文分出的 6个特异性 phagescFv 单克隆中有 3个克隆的 DNA序列与以前报道的完全相同，1 个克隆仅在 CDR中有 2个氨基酸残基不同，2 个克隆的 DNA序列完全不同于以前报道，结果提示 CD44和 CD34分子在 KG1a细胞表面的定位距离不远。DNA序列测定，结果显示 C95和 H1两个克隆的 CDR都很独特，推测它们可能识别不同的抗原，免疫印迹
