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1、1特异性抑制 Ik1 具有抗心律失常的作用摘要 目的 探讨特异性抑制内向整流性钾电流(Ik1)是否具有抗心律失常的作用。方法 采用特异性抑制心脏 Ik1 转基因小鼠，改良的Langendorff 小鼠心脏灌注系统同步记录心电图、单向动作电位(MAP)及复极离散度。并采用房室结机械消融及氟烷诱发心律失常。结果 转基因组小鼠房室结消融前后室性早搏的发生率明显低于对照组，且其诱发室速(VT)的氟烷阈值浓度显著高于对照组。其发生机制可能与转基因组 MAP 时间及复极离散度较对照组低有关。结论 Ik1 在心律失常的发生中起着重要作用，特异性抑制 Ik1 可能为未来抗心律失常的有效策略之一。关键词 内向整
2、流性钾电流；小鼠；心律失常Antiarrhythmic effects of specific inhibition of Ik1 in mouse heartAbstract Objective To gain further insights into the role of specific inhibition of IK1 in arrhythmogenesis.Methods Using transgenic mice expressing dominant negative Kir2.1-AAA subunits in the heart(TG)and wild-type con
3、trol mice(WT)，we studied the response of specific inhibition of IK1 to atrial-ventricular node ablation and halothane challenges in Langendorff-perfused heart models.Isolated heart ECG and monophasic action potentials were measured.The number of premature ventricular contractions(PVCs)and ventricula
4、r tachycardia(VT) were calculated during the 5 minutes period after above challenges.Results In isolated hearts，the threshold concentration for halothane-induced VT was1.7 fold higher in the TG than in the WT type hearts.The number of PVCs induced by AV node ablation was reduced in TG hearts and inc
5、reased in WT mice.Analysis of monophasic action potentials in isolated hearts shows a significant reduction in the dispersion of action potential repolarization in mice with suppressed IK1.Conclusion The data strongly support the hypothesis that IK1 plays a significant role in the generation of card
6、iac arrhythmias，and that IK1 blockade in cardiac myocytes may be a potentially useful antiarrhythmic strategy.Key words specific inhibition IK1;mouse;arrhythmia临床上心肌病及各种原因所致的心衰均伴随着内向整流性钾电流(Ik1)的下调1 。由于目前缺乏特异性的 Ik1 抑制剂，对其下调是否具有有益的抗心律失常作用则仍存在争议。理论上讲，抑制 IK1 会降低静息膜电位的稳定性，促进除极化，使自律性增加，而具有导致心律失常的作用2 。但是抑制
7、 IK1 可均一地延长动作电位时间和不应期，降低心室复极离散度而防止折返的形成，延缓异常2兴奋的传播，又具有抗心律失常的作用3 。本研究采用转基因特异性抑制 Ik1小鼠，使用 Langendorff 离体心脏模型，以房室结机械消融和氟烷诱导心律失常，并检测了单向动作电位时间和复极离散度，为探讨上述争议提供了有力的依据。1 对象与方法1.1 特异性抑制心脏 Ik1 转基因小鼠建立 将 Kir 2.1 选择性滤过部位的签字序列 GYG 突变为 AAA，其 C 端与 GFP 连接，并与 -肌球蛋白重链启动子连接后，将其全部基因注射于 C57BL/65JL 受精卵，建立转基因鼠4 ，采用 PCR 鉴定
8、 GFP 表达，将阳性表达者作为转基因组(TG)，而将阴性表达者作为对照组(WT)。1.2 离体灌注心脏心电生理的检测 以 Avertin 麻醉小鼠，取出心脏，用台氏液浸洗，快速将主动脉与灌注针头连接，用台氏液(含 2.5 mM CaCl2)逆行灌注 12 min 后，将心脏置于 Langendorff 逆向主动脉灌注系统，用以 95%加5%CO2 充气的 Krebs-Henselet 溶液(37)灌注。灌注压为 80 mmHg，将心脏浸泡于充气循环的 Krebs-Henselet 溶液中，稳定 1020 min 后，行各项心电生理指标的检测。检测离体心脏心电图时将 3 个 Ag+-AgCl
9、电极置于心脏周围。单相动作电位的测定采用直径为 0.01 吋外包特氟隆的银丝制作电极，电极尖端以砂纸磨光后置于 3 M 氯化钾溶液中以 4.5 V 直流电镀氯。检测时将电极轻推置于心脏表面进行记录，时间少于 1 min，以降低其对心脏的损伤。1.3 房室结消融和氟烷干预诱导心律失常 房室结的机械消融采用镊子轻轻钳夹房室结部位，造成房室传导阻滞。采用氟烷诱发心律失常则是在灌注系统顶端的储水小槽中(4 ml)注入不同量的饱和氟烷溶液(17.5 nmol/L)。最初注入300 l，然后以此量加减直至诱发出室速(VT)。1.4 统计学方法 所有资料均表示为均数标准差(xs)，比较采用 t 检验。2 结
10、果2.1 房室结消融对心律失常发生的影响 见表 1。房室结消融造成度 AVB后，在心尖部以 150 ms 间期(即 400 次/min)起搏心脏，检测 VT 和室性早搏(PVC)在两组的发生率()和发生的次数。结果显示：消融前后，PVC 的发生率在 TG 组较 WT 组均少 22.5 倍，而且发生次数无显著性差异。消融后 WT 组有两只小鼠出现 VT，而 TG 组则无。表 1 房室结消融对离体心脏心律失常发生率和发生次数的影响2.2 单相动作电位的检测 为探讨 Ik1 在心脏兴奋中的机制，我们检测了离体心脏单相动作电位及心室复极离散度。结果发现：TG 组较 WT 组 MAP 75%及90均显著
11、延长。而且 TG 组心室复极离散度(为左室 MAP-右室 MAP)显著低于 WT3组。见表 2。表 2 离体心脏各部位单相动作电位(MAP)75%和 90%值 (xs)注：*P0.012.3 氟烷对心律失常发生的影响 为进一步检测特异性抑制 IK1 是否抗心律失常，采用氟烷诱发心律失常。结果发现：诱发 VT 的阈值浓度在 TG 组(n=10)较 WT 组(n=10)高 67%(见图 1)。图 1 氟烷对心律失常发生的影响3 讨论Ik1 在心肌复极化晚期恢复电导，从正性膜电位起点到平衡电位间的 Ik1外向电流起着促进终末期复极和稳定静息膜电位的作用5 。此外，在动作电位平台期(+20+50 mV
12、)其内向整流特性维持着非常低的电导，该电导所产生的相对较小的内向电流参与动作电位平台期的稳定与形成5 。许多研究表明，IK1在高血压性心肌肥大和心衰动物模型以及人类心衰、心肌病时下调1 。但电重塑时 IK1 下调是否具有代偿性保护作用仍有待澄清。长期以来，因无特异性 IK1 抑制剂，对 IK1 下调是否具有抗心律失常作用尚存在争议。支持抑制 IK1 导致心律失常的研究包括:(1)采用腺病毒转基因技术将 Kir2.1 突变基因转染豚鼠心脏某个部分抑制 IK1 引起心律失常增加6 。(2)临床上长 QT 间期综合征 7 型(全身性 Kir2.1 突变致 IK1 降低)虽无心脏结构改变和心源性猝死，
13、但室性心律失常发生率增加7 。(3)Kir2.1 和 Kir2.2 基因敲除老鼠出生后 812 h 因继发腭完全缺裂不能进食而死亡，在其心肌细胞不能检测到 Ik18 。支持抑制 Ik1 抗心律失常的研究主要是药物研究，包括:(1)RP58866 和其活性成分 Terikalant(RP-62719)可抑制 IK1 并具有抗心律失常和抗颤动的作用9 ，但后来发现该药物抑制延迟整流钾电流快速激活成分(Ikr)的作用比抑制 IK1 的作用强 250 倍10 。所以，不能认为其抗心律失常的作用仅是抑制 IK1 所致。(2)Ik1 抑制剂 UK66914 在大鼠和兔心脏具有抗缺血/再灌流心律失常的作用，
14、但该药物抑制多种钾电流11 。(3)JTV-519 抑制 Ik1 并具有抗心律失常的作用，但该药也抑制钠电流与钙电流12 。(4)氨氯吡咪抑制 Ik1 并可抑制室速的发生，但其作用还包括抑制钙电流等13 。(5)在豚鼠心脏采用氯化钡抑制 Ik1 可终止室颤的发生，但氯化钡也可抑制其他钾电流14 。本研究采用的特异性抑制心脏 Ik1 的鼠系，其存活率与对照组相同，无心律失常；55.8%的心肌细胞显示转基因表达，而无心脏肥大，转基因表达的心肌细胞 Ik1 抑制程度达 95%4 。我们的研究表明，转基因特异性抑制 IK1 小鼠离体心脏在房室结机械消融前后其 PVC 的发生率较对照组明显为多，且需要更
15、高浓度的氟烷来诱发 VT，高度提示特异性抑制 IK1 具有抗心律失常的作用。其机制可能是特异性抑制 IK1 均一地延长动作电位时间和不应期，从而可能降低心室复4极离散度而防止折返的形成，延缓异常兴奋的传播，发挥抗心律失常的作用。本研究的临床意义在于在心衰、心肌病发生发展中，IK1 的下调至少在一定阶段中起着有益的代偿作用，另外开发特异性的 IK1 抑制剂可能为未来治疗心律失常提供有益的手段。参考文献1 Janse MJ.Electrophysiological changes in heart failure and their relationship to arrhythmogenesis
16、.Cardiovasc Res，2004，61(2):208-217.2 Opthof T.IK1 blockade is unlikely to be a useful antiarrhythmic mechanism.Cardiovasc Res，1994，28(3):420.3 Rees SA，Curtis MJ.IK1 blockade is a potentially useful antiarrhythmic mechanism.Cardiovasc Res，1994，28(3):421-422.4 McLerie M，Lopatin A.Dominant-negative suppression of I(K1) in the mouse heart leads to altered cardiac excitability.J Mol Cell Cardiol，2003，35(4):367-378.5 Lopatin A
