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1、1灯盏细辛抑制外源性 VEGF 诱导的大鼠视网膜血管病变 TGF1 的表达【摘要】目的：探讨灯盏细辛(EBHM)对外源性 VEGF 诱导的大鼠视网膜血管病变眼玻璃体腔 TGF1 和视网膜 TGF1 mRNA 表达的影响。方法：大鼠 48 只随机分为 rrVEGF164,rrVEGF164 + EBHM, rrVEGF164+NS 和正常对照 4 组。rrVEGF164+EBHM 组每天 60g/L 的灯盏细辛浸膏 ip。分别于不同时间收集玻璃体液后采用 ELISA 检测 TGF1 的浓度,并提取视网膜总的 RNA 后行 RT-PCR 检测TGF1 mRNA 的表达。结果：在 2wk 或 6wk
2、 时 VEGF、VEGF+NS 和 VEGF+EBHM 组实验眼玻璃体内 TGF1 的浓度均高于正常对照组 （P 0.05） 。VEGF+EBHM 组低于 VEGF 组和 VEGF+NS 组（P 0.05） 。各组 TGF1mRNA/GAPDHmRNA 的差异与玻璃体内的 TGF1 浓度变化一致。结论：rrVEGF164 作用大鼠玻璃体内TGF1 浓度升高，视网膜 TGF1 mRNA 表达增强。灯盏细辛能部分抑制rrVEGF164 诱导的大鼠视网膜血管病变玻璃体内 TGF1 浓度的升高和视网膜TGF1 mRNA 表达的增强。 【关键词】 重组大鼠血管内皮生长因子灯盏细辛转化生长因子 1Inhi
3、bition of EBHM on the expression of TGF1 in the retinal vasculopathy induced by exogenous VEGF in ratsAbstract AIM: To investigate the effects of EBHM on TGF1 in the vitreous and the expression of retinal TGF1 mRNA in the retinal vasculopathy induced by exogenous VEGF in rats. METHODS: Forty-eight r
4、ats were randomly divided into four groups: rrVEGF164, rrVEGF164+NS, rrVEGF164+EBHM and normal group. Rats in rrVEGF164+EBHM group were administrated intraperitoneally with 60g/L EBHM solution. Captured vitreous humor and total extracted retinal RNA were analyzed by ELISA for the concentration of TG
5、F1 and RT-PCR for expression of TGF1 mRNA in different time respectively. RESULTS: Two or six weeks after the first of intravitreal rrVEGF164 injection, the concentration of TGF1 in the vitreous of experiment eyes among rrVEGF164, rrVEGF164+NS and rrVEGF164+EBHM group were higher than that of in nor
6、mal group(P 0.05). The concentration of TGF1 in the vitreous of experiment eyes in rrVEGF164+EBHM group were lower than that of in rrVEGF164 and rrVEGF164+NS group (P 0.05).The differences in the ratio of TGF1 mRNA and GAPDHmRNA in every group were as same as that in the change of concentration of T
7、GF1 in the vitreous. CONCLUSION: TGF1 in the vitreous and expression of TGF1mRNA increased after intravitreal rrVEGF164 injection.EBHM has partial inhibitory influncence on the elevated concentration of TGF1in the vitreous and expression of TGF1mRNA in the retinal vasculopathy induced by 2exogenous
8、rrVEGF164 in rats. KEYWORDS: rrVEGF164; EBHM; TGF10 引言血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知最重要的血管新生促进因子，而转化生长因子 1 (transforming growth factor1,TGF1)的生理作用比较复杂，对于不同的靶细胞以及同一靶细胞的不同状态下，显示出不同作用。体外实验表明 TGF1 能增加细胞 VEGF 的分泌，而 VEGF 是否对 TGF1 具有何种作用，未见报道。为了阐明外源性 VEGF 对TGF1 的相互作用，我们检测了外源性 VEGF 诱
9、导的大鼠视网膜血管病变模型眼TGF1 的表达情况，并研究了灯盏细辛erigeron breviscapus(vant.)Hand-mazz，EBHM对其表达的影响。1 材料和方法1.1 材料 Sprague-Daweley 大鼠(中南大学湘雅二医院动物实验中心提供, 雌雄各半，体质量 200240g) 48 只随机分为 4 组(每组 12 只): 正常对照组,不作眼内注射。VEGF 组实验眼(右眼)玻璃体腔注射浓度为 100mg/L rrVEGF164 4L，隔天 1 次，共 4 次。自身对照眼(左眼)，注射等量的 0.1mol/L PBS，注射频率与实验眼一致。VEGF+EBHM 组于玻璃体
10、腔注射当天开始，按 150mg/kg 体重，60g/L 的灯盏细辛 (EBHM) 浸膏 ip，每天 1 次。VEGF+NS 组于玻璃体腔注射当天开始，按 EBHM 计量，生理盐水 ip，每天 1 次。VEGF+EBHM，VEGF+NS 组实验眼和自身对照眼玻璃体腔注射与 VEGF 组相同。每组分别于 2wk 和 6wk 在散瞳后直接眼底镜观察眼底后各处死 6 只。酶联免疫检测仪（芬兰 Labsystems 公司）, 基因扩增仪（PE9600，美国 PE 公司） ,TGF1ELISA 试剂盒（上海森雄试剂公司）,扩增 TGF1cDNA 引物（上海生物工程有限公司）正义链：5-GCTAATGGTG
11、GACCGCAAC-3 ,反义链：5-GCAGTGAGCACTGAAGCGA-3。扩增内对照 GAPDHcDNA 引物（上海生物工程有限公司）正义链：5-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3，反义链：5-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3。RT-PCR试剂盒（Promega 公司，美国） ，玻璃毛细管，重组大鼠血管内皮生长因子（rrVEGF164，Sigma 公司） 。1.2 方法 大鼠充分散瞳后，30g/L 戊巴比妥钠溶液（1mL/kg）ip 麻醉。结膜囊表面麻醉，眼科手术显微镜下用 30#B-D 针头于背侧角膜缘后 1mm 处刺穿眼球壁后立即出针，角膜缘行前房穿刺，消毒剪刀将
12、自制玻璃体腔微量注射针针尖剪去，暴露开口。10L 加样移液器抽取 rrVEGF164 或 PBS 4L 注于消毒的点样纸上。自制玻璃体腔微量注射针立即吸取。沿预先穿刺好的针孔处以45o50o 的角度进入眼内并缓慢注射，停留约 15s 后拔针。术眼涂眼膏，术后3d 3g/L 诺氟沙星滴眼液滴眼，每天 2 次。注射 rrVEGF164 或 PBS 前、后，出现玻璃体出血者不纳入实验对象。深度麻醉大鼠后摘除眼球，去除眼前节和玻璃体，吸取玻璃体液于离心管内，剥取视网膜于冻存管内。玻璃体液在制冷离心机 4下 3 000rmin 离心 20min，收取上清液，移于 EP 管内，-70冰箱保存。3TGF1E
13、LISA 按试剂盒说明书进行。冻存管内视网膜立即放入液氮内，-70冰箱保存。Trizol 提取视网膜组织总的 RNA,RT-PCR 反应,取 PCR 产物 4L，在10g/L 的琼酯糖凝胶上电泳，100V 45min，在紫外灯下观察并照相。应用ImageMasterVDS 3.0 软件分析系统，对 RT-PCR 琼酯糖凝胶结果成像并行电泳条带光密度测定。统计学处理: 资料正态检验,方差齐性检验后, 数据均用均数标准差表示，不同组间用方差分析,采用 SPSS for Windows 11.5 统计软件处理，P 0.05认为统计学差异有显著性。 2 结果2.1 玻璃体液 TGF1 含量 2wk 时
14、 TGF1 VEGF、VEGF +NS 和 VEGF+EBHM 组右眼玻璃体内 TGF1 的浓度均高于正常对照组（P 0.05） 。VEGF+EBHM 组低于 VEGF 和 VEGF+NS 组（P 0.05） 。6wk 时上述各组右眼玻璃体内 TGF1 的浓度无明显变化（表 1） 。2.2 视网膜 TGF1mRNA 表达紫外灯下观察到 28S、18S、5S 条带，比例适当。经紫外分光光度仪测定各样本纯度 A 260/A 280 介于 1.82.0 之间。所有实验组和对照组均检测到 TGF1 基因和内参照 GAPDH 基因的表达。400bp 附近条带为 TGF1 DNA（340bp） ，未出现明
15、显杂带。在 300bp 附近有一条带即为内参照 GAPDH DNA 条带（298bp） ，表明扩增产物具有较高的特异性（图 1） 。所有组双眼均有 TGF1mRNA 表达。正常组有弱表达，VEGF 注射后 TGF1mRNA 表达增强，EBHM 治疗后 TGF1mRNA 表达略有增强。2wk 时, VEGF 组、VEGF+NS 组和VEGF+EBHM 组右眼视网膜 TGF1mRNA/GAPDHmRNA 比值均高于正常对照组（P 0.05） 。VEGF+EBHM 组低于 VEGF 组和 VEGF+NS 组（P 0.05） 。6wk 时上述各组右眼视网膜 TGF1mRNA/GAPDHmRNA 比值无
16、明显变化（表 2） 。图 1 注射 rrVEGF164 眼视网膜 TGF1mRNA 的表达 1.正常对照；2.VEGF 2wk；3.VEGF+EBHM 2wk；4.VEGF+EBHM 6wk;5.VEGF 6wk;6.VEGF+NS 2wk;7.VEGF+NS 6wk;8.DNA Ladder3 讨论TGF-1 是 TGF 家族中研究最多的多肽之一,生物学作用比较复杂。对视网膜、脉络膜血管内皮细胞的离体、在体的作用，文献报道不一。Mandnota 等研究发现,TGF-1 降低牛微血管内皮细胞 FLK-1 mRNA 和蛋白质的表达。他们认为,TGF-1 是内皮细胞 VEGF/FLK-1 信号转导途径的重要调节因子。视网膜广泛光凝后，视网膜色素上皮细胞表达 TGF-1 持续升高，在后期可能存在抑制细胞增生的作用。以往研究注重于 TGF1 对 VEGF 的作用，本研究显示,正常大鼠玻
