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1、ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB 37/T XXXXXXXXX牛支原体诊断技术规程Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma BovisXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/ XXXXXXXXX目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语与定义14 试剂及仪器14.1 试剂14.2 仪器25 样品采集与处理25.1 疑似牛支原体感牛只的判断25.2 疑似病例样品的采集25.3 样品处理26 微生物学检测法26.1 液体培养26.2 菌落形态观察26.3 D
2、ienes染色36.4 生化试验36.5 结果判定37 核酸检测法37.1 DNA模板的制备37.2 PCR检测37.3 凝胶电泳47.4 质量控制47.5 结果判定48 废弃物的处理和检测过程中安全措施49 操作注意事项5附录A （规范性附录） 培养基的制备方法6前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧兽医局。本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。6牛支
3、原体诊断技术规程1 范围本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方法、核酸检测方法和操作注意事项等。本标准适用于牛支原体的实验室诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 66822008分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14926.82001实验动物支原体检测方法GB 159811995消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB 194892008实验室生物安全通用要求3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。
4、3.1牛支原体Mycoplasma bovis柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种疾病的病原之一。3.2Dienes染色液一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。3.3类胸膜肺炎微生物培养基Pleuropneumonia-Like Organisms medium，PPLO培养基该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用于多种支原体的分离和培养。4 试剂及仪器4.1 试剂去离子水（符合GB 66822008的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录A；Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液；生理
5、盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖4.2 仪器接种环、酒精灯、移液器（5100 L和1001 000 L）、枪头（200 L和1 mL）、培养试管（15 mL）和玻璃平皿（90 mm）、CO2恒温培养箱、移液器、1 L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭菌锅、正置光学显微镜。5 样品采集与处理5.1 疑似牛支原体感牛只的判断5.1.1 肺炎型，主要表现为咳嗽、喘，有清亮或脓性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎；不同病死牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布。5.1.2 乳腺炎型，主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎，前者乳汁带血或呈灰色，后者
6、体细胞数较高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。5.1.3 关节炎型，主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节炎淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。5.2 疑似病例样品的采集根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下：a) 肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中；b) 乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约15 mL，置注射器或无菌容器中；c) 关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约2 mL5 mL，置注射器或无菌容器中。5.3 样品处理5.3.1 组织样品的处理剪至云雾状后，用
7、2 mL生理盐水重悬，7 500g离心5 min，用注射器吸取1 mL上清液经0.45 m滤膜滤过后备用。5.3.2 鼻拭子的处理用2 mL生理盐水浸润拭子后，7 500 g离心5 min，吸取1 mL上清液经0.45 m滤膜滤过后备用。5.3.3 奶样或关节液样品的处理分别取1 mL原液与1 mL生理盐水充分混合，7 500 g离心5 min，用注射器吸取1 mL上清液经0.45 m滤膜滤过后备用。6 微生物学检测法6.1 液体培养将0.5 mL“5.3”所述处理所得上清液加入到含4.5 mL PPLO液体培养基的试管中，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养3天，选择PPLO液体培养基由红
8、色变为黄色且透亮的培养液用于进一步检验。6.2 菌落形态观察取50 L疑似液体培养阳性的样品加入到PPLO固体培养基（配方见附录A）上，涂布均匀后，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养35天后，4倍物镜下观察菌落形态。6.3 Dienes染色将有可疑菌落的固体培养基平皿进行Dienes染色，37 孵育30 min后，观察菌落颜色。6.4 生化试验6.4.1 洋地黄皂苷敏感试验将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于含0.2 mg/mL洋地黄皂苷的PPLO液体培养中，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明洋地黄皂苷敏感；当培养基颜色变黄时
9、，说明洋地黄皂苷不敏感。6.4.2 葡萄糖发酵试验葡萄糖发酵试验培养基配制方法见“附录A”。将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于葡萄糖发酵试验培养基中，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明不发酵葡萄糖；当培养基颜色变黄时，说明发酵葡萄糖。6.4.3 精氨酸水解试验精氨酸水解试验培养基配制方法见“附录A”。将“6.1”中变为黄色的培养液，1:10接种于精氨酸水解试验培养基中，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变或变黄时，说明不水解精氨酸；当培养基颜色变红时，说明水解精氨酸。6.5 结果判定当
10、同时满足以下条件时，判定为牛支原体阳性：a) 镜检存在圆形、中间有颗粒或隆起的煎蛋样菌落；b) Dienes染色菌落为蓝色；c) 生化鉴定结果为洋地黄敏感、不能发酵葡萄糖、不能水解精氨酸。其他情况均视为牛支原体阴性。7 核酸检测法7.1 DNA模板的制备7.1.1 水煮法取“5.3”所述的上清样1 mL于灭菌的2 mL Eppendorf管中，12 000g离心12 min，弃上清，沉淀重悬于200 L无菌ddH20中，沸水浴15 min后立即冰浴2 min，待Eppendorf管冷却后12 000g离心10 min，取上清液即为样品DNA模板。7.1.2 试剂盒法提取样品DNA模板时，采用商
11、品化的支原体基因组DNA提取试剂盒或革兰氏阴性菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，操作步骤参照商品化试剂盒说明书。7.2 PCR检测7.2.1 PCR反应引物参照国际上常用的PCR诊断方法，选择针对牛支原体设计的一对特异性引物用于PCR检测（Subramaniam, et al. Molecular & Cellular Probes, 1998.），目标产物大小为1 626 bp，引物信息如下：MBOUVRC2-L：5- TTACGCAAGAGAATGCTTCA -3MBOUVRC2-R：5- TAGGAAAGCACCCTATTGAT -37.2.2 PCR反应体系经“7.1”提取的样品DNA
12、模板，以牛支原体DNA作为阳性对照，ddH2O为阴性对照。PCR反应体系如表1。表1 牛支原体PCR反应体系中各成分添加量试剂名称用量Taq 酶（1 000 U/mL）1 L10反应缓冲液（含镁离子）2 LdNTP（10 mM）1 L上游引物（10 M）1 L下游引物（10 M）1 L检测模板5 LddH209 L总体积20 L7.2.3 PCR反应条件95 预变性5 min；循环设置为95 变性30 s，52 退火30 s，72 延伸1.5 min，设置36个循环；72 充分延伸10 min；降温至4 后取出产物待检。7.3 凝胶电泳采用1.5 %琼脂糖凝胶，在120 V电压下，电泳35 m
13、in后，通过凝胶成像系统观察样品孔是否存在大约1 600 bp左右的亮带。7.4 质量控制若阳性对照存在1 600 bp左右的亮带，且阴性对照无此亮带，即阴阳性对照成立，可进行结果判定；反之，则应重复PCR检测试验。7.5 结果判定电泳结果存在1 600 bp左右亮带，所对应样品被判定为牛支原体阳性；其他情况均可被判定为牛支原体阴性。8 废弃物的处理和检测过程中安全措施 按照GB 194892008中规定执行。9 操作注意事项9.1 牛支原体的分离培养与检测应在独立试验空间进行，严格进行无菌操作，以避免交叉污染。9.2 采集样本应避免冷冻或高温，冷藏条件下48 h内送实验室进行检测。9.3 支
14、原体培养基的配置应选用去离子水。9.4 从高度疑似样品中分离培养支原体时，如液体培养无变色，应继续盲传23代。9.5 培养、PCR和染色检测，均应设置阴性对照和阳性对照。AA附录A （规范性附录）培养基的制备方法A.1 PPLO液体培养基（pH值为7.6）PPLO粉21.0 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸钠2.0 g，溶于850 mL ddH2O中，加入1 % (w/v) 酚红溶液4 mL，116 灭菌20 min（按照GB 159811995执行），加入56 灭活的马血清150 mL和20万单位青霉素，调节pH值为7.6，每4.5 mL分装至15 mL培养管，冷藏保存1个月。A.2 PPLO固体培养基（pH值为7.6）PPLO粉21.0 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸钠2.0 g，琼脂粉20.0 g，溶于850 mL ddH2O中，加入1 % (w/v) 酚红溶液4 mL，116 灭菌20 min（按照GB 159811995执行），冷却至55 左右。无菌操作加入56 灭活的马血清150 mL和20万单位青霉素，调节pH值为7.6，每15 mL倒入90 mm无菌培养皿，冷却凝固，室温保存1周，冷藏保存1个月。A.3 葡萄糖发酵试验培养基PPLO粉2.1 g，酵母粉0.2
