第四章-工业发酵灭菌与除菌

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1、第四章 工业发酵灭菌,现代发酵技术,完整发酵生产工艺流程: （1）原料的选择和预处理 （2）微生物菌种的选育和种子扩大培养 （3）培养基的配制和灭菌 （4）无菌空气的制备 （5）发酵 （6）产物的分离提取 （7）产物的精制干燥 （8）废物的回收利用。,现代发酵技术,染菌的危害,一、经济上巨大损失； 消耗营养； 分解产物； 抑制产生菌生长； 产物合成下降； 影响提取； 影响产品外观及内在质量； 扰乱生产秩序，破坏生产计划,影响工人的情绪和生产积极性。,现代发酵技术,染菌的危害,二、生产危害； 杂菌使生产菌菌体自溶 产生大量泡沫，影响发酵过程的通气搅拌，造成逃液； 发酵液发粘，过滤时不能或很难形成

2、滤饼，过滤困难。 染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。,现代发酵技术,染菌的危害-实例,谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡； 染芽孢杆菌，芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。 青霉素发酵染菌 绝大多数杂菌都能被青霉素诱导而产生青霉素酶； 不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。,现代发酵技术,工业发酵灭菌,消除杂菌要求： 培养基灭菌 发酵罐及附属设备灭菌 空气灭菌,现代发酵技术,第一节 灭菌的方法,定

3、义： 灭菌：指用化学或物理方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命体的工艺过程，包括微生物的营养体和芽孢。 消毒：用物理化学方法杀死环境中的病源微生物。,现代发酵技术,第一节 灭菌的方法,分类 加热灭菌 化学药品灭菌 辐射灭菌 过滤除菌,现代发酵技术,一 热灭菌法,现代发酵技术,现代发酵技术,干热灭菌,1.干热灭菌法: 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150170下维持12小时后，即可达到彻底灭菌的目的。 在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。,现代发酵技术,2.湿热灭

4、菌法,湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。 多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理510min后即可杀死； 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80以上的温度处理才能杀死； 而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。,现代发酵技术,干热与湿热穿透力及灭菌效果比较,现代发酵技术,蛋白质含水量与凝固所需温度,现代发酵技术,蒸汽压力与蒸汽温度换算关系,现代发酵技术,常见的湿热灭菌法,煮沸灭菌法 巴氏灭菌 间歇灭菌 高压蒸汽灭菌,现代发酵技术,A.常压法,煮沸灭菌法： 100下保持15-20分钟，一般不能杀死芽孢。 巴氏消毒法是一种低温消毒法 低温：60-62下保持30分钟可进行牛奶消毒； 高

5、温：72下保持15分钟即可。,现代发酵技术,间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。 方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。,现代发酵技术,B.加压法,盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至121维持1520分钟，也可采用在较低的温度115下维持30分钟的方法。 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。,现代发酵

6、技术,湿热法灭菌要点,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,现代发酵技术,C.连续加压灭菌法,在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135140下处理515秒钟。,现代发酵技术,高温灭菌的操作,高温短时间灭菌 高压蒸汽灭菌能有效地杀灭杂菌，也能破坏营养成分； 热的作用下，某些营养还相互发生反应，甚至生成毒物： 灭菌中，温度升高，菌体死亡速率的增加远大于营养成分破坏的增加。,现代发酵技术,二、辐射灭菌,紫外线、X射线等。 原理：高能量的电

7、磁辐射和微粒辐射使核酸、蛋白质和酶变性； 适用：表面、局部空间,现代发酵技术,三、化学物质灭菌,甲醛、苯酚、高锰酸钾、洁尔灭等。 原理：蛋白质变性；酶失活；破坏细胞膜透性。 适用：厂房、无菌室、器具等的消毒。,现代发酵技术,四、臭氧灭菌无污染消毒剂,原理：利用臭氧的氧化作用灭菌； 适用：洁净室及净化设备,现代发酵技术,五、过滤灭菌,醋酸纤维、尼龙、聚丙烯等。 原理：微孔滤膜； 适用：热敏性物质、空气。,现代发酵技术,第二节 培养基和发酵设备的灭菌,灭菌方法湿热灭菌 一 培养基灭菌条件 1.灭菌温度和时间的选择 2 影响培养基灭菌效果的因素 二、发酵培养基的灭菌 （一）分批灭菌 （二）连续灭菌,

8、现代发酵技术,高温对培养基成分的有害影响及其防止,现代发酵技术,1.灭菌温度和时间的选择,a.微生物的热致死温度 应高于该温度,通常以芽孢为准。 b.营养成分的破坏 灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。 应采用高温短时 灭菌,现代发酵技术,1、灭菌时间的确定 在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。因此对数穿透定律是指在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，也就是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。 dN/dT=kN,现代发酵技术,一级反应动力学 dN/dT=kN N残留的活菌数 K-灭菌死亡

9、速率常数,S-1或min-1 T-灭菌时间，s或min,现代发酵技术,在恒定灭菌温度下，对某一种微生物而言k可为常数，对两边积分，得对数残留定律公式： dN/dT=kN,现代发酵技术,例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1ml有2105个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间t 。,解:,N0=401062105=81012(个),Nt=0.001(个),k=1.8min-1,则:,灭菌时间,现代发酵技术,应注意的问题：（1）灭菌时间取决于污染程度(N0)灭菌程度(Ns) ；（2）灭菌程度即残

10、留菌数，如果要求完全灭菌，即Ns0，则t接近于无穷大，这在事实上是不可能的。故在工程上进行灭菌设计时常以Ns103。也就是每处理1000批培养基只允许一次失败作为计算的依据。（3）灭菌速率常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，随物种和灭菌温度而异。在相同温度下，k值越小，微生物越耐热。（4）同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，K值越小，灭菌温度越高，K值越大。,现代发酵技术,培养基灭菌温度的选择,培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。在生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。 灭菌过程

11、微生物死亡是属于一级反应动力学类型，在其它条件不变时，反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示,A为比例常数,E为杀死细菌所需活化能,R为气体常数,T为绝对温度（K）,现代发酵技术,以lgk对1T标绘得一直 线，其斜率为 截距为lgA，从斜率和截距可求得A和E,现代发酵技术,培养基成分受热破坏是化学分解反应，符合一级动力学反应，可用下式表示：t,培养基成分受热破坏是化学分解反应，符合一级动力学反应，可用下式表示：,c为反应物浓度（mol/L）,t为反应时间（min）,k为化学反应速度常数（min）,T为绝对温度（K）,现代发酵技术,在化学反应中，其他条件不变时，反应速度常数与温度的关系

12、也可用阿累尼乌斯方程式表示：,在灭菌时，当温度变化，菌体死亡速度常数k和培养基成分破坏速度常数k都发生了改变。温度由T1升高到T2，k值分别为：,现代发酵技术,同样，灭菌时，培养基成分的破坏也可得类似关系：,所以：,现代发酵技术,杀灭细菌芽孢的活化能E大于B族维生素破坏的活化能E（见 下表）。因此， 大于 ，即随着温度上升，灭菌速率常数增加倍数大于培养基成分分解的速度常数的增加倍数。也就是说，温度升高，菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。,达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长使营养成分遭到破坏的损失。不同温度的灭菌时间及培养基营养成分的破坏情况，见表

13、。,现代发酵技术,在实际生产中以芽胞的死亡作为灭菌的依据； 不可能绝对杀灭微生物（无活菌残留），一般要求微生物污染降低到处理1000罐中只残留1个活菌，此数已能满足生产的要求。,现代发酵技术,二、影响培养基灭菌的因素,1.培养基成份: 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会提高微生物的耐热性。高浓度有机物会在细胞周围形成一层薄膜，影响热的传入，所以灭菌温度高些。 例如，大肠杆菌在水中加热6065便死亡，在10%糖液中，需7046min，在30%糖液中7030min。 12%的NaCl溶液对微生物有保护作用。随着浓度的增加，保护作用减弱，如浓度超过810，则微生物的耐热性降低。,现代发酵技术,二、影响培

14、养基灭菌的因素,2.培养基的物理状态： 液体培养基中除热的传道传递外，还有对流，所以比较容易灭菌，而固体则比较难于灭菌。 培养基中的颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。一般含有小于1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。,现代发酵技术,3.pH值的影响 pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0-8.0时微生物最不易死亡,pH6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。,现代发酵技术,4.培养基中微生物数量 微生物数量越多，灭菌需要的时间越长，灭菌难度越大。 5.微生物细胞中含水量 微生物含水量越高，细胞内的蛋白质凝固温度越低，越容易受热而丧失生命力。 6.微生物细胞的

15、菌龄 年轻细胞含水量高，年老细胞含水量低，所以年老细胞不容易被杀死。,现代发酵技术,7.微生物的耐热性 不同微生物的耐热性不同，细菌芽孢最强，营养体最弱，放线菌、霉菌比细菌营养体要强。 8.空气排除情况,现代发酵技术,二、培养基的灭菌方法,分批灭菌 连续灭菌,现代发酵技术,1、分批灭菌（实罐灭菌),定义： 将配置好的培养基加入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定的时间，再冷却至发酵所需温度。 优点： 不需要其他附属设备，操作简便，是国内外生产中常用方法： 缺点： 加热和冷却时间长，营养成分有一定损失，罐利用率低，不能采用高温快速工艺。,现代发酵技术,1、分批灭菌（实罐灭

16、菌),过程 分批灭菌三个过程： 升温、保温和冷却； 发酵罐容积越大，加热和冷却时间越长，这两段时间也在灭菌，灭菌主要在保温过程； t总=t1+t2+t3 （t1、t2 和t3分别表示加热、维持和冷却所需要的时间）,现代发酵技术,3灭菌的主要步骤： （1）培养基的输送：通过专用管道输入发酵罐中。 （2）灭菌前的准备工作：检查水、电、气以及发酵罐的密封性是否正常，将空气过滤器灭菌，灭菌后将过滤器装上发酵罐。,现代发酵技术,（3）加热：控制进水阀和出水阀，调节水压使水压表指针指示在0.250.3之间，使水充满加热器，防止烧坏加热器；打开发酵罐的总电源；打开搅拌器的电源开关，使搅拌器转速控制在300350rpm；打开温度控制器的电源开关。,现代发酵技术,（4）保温：121，灭菌30min （5）冷却：