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1、1急性移植物抗宿主病病人 Th 细胞亚群变化及其临床意义作者：王书红,达万明,靳海杰,靖彧,苏荣,阮秀霞【摘要】 本研究探讨异基因造血干细胞移植（alloHSCT ）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）时 Th 细胞亚群的数量变化及其临床意义。观察了 23 例alloHSCT 患者 aGVHD 的发病情况， aGVHD 的诊断主要依据临床表现，对部分病例进行了皮肤活检，取得病理学依据。移植前后定期采集 23 例患者的外周血，采用流式细胞仪检测其 Th 细胞亚群 Th1、Th2 细胞比例的变化。结果表明： 23例患者 8 例发生了 aGVHD，其中 3 例度，2 例度，3 例度 aGVHD， 15
2、 例未发生 aGVHD。流式细胞术检测显示，发生 aGVHD 患者的 Th1 细胞量明显高于未发生 aGVHD 患者（p0.01） ，-度 aGVHD 患者 Th1 细胞的 IFN 表达明显高于未发生 aGVHD 患者（p0.01） ，而 Th2 细胞的 IL4 表达明显低于未发生aGVHD 患者，动态观察发现在 aGVHD 发生前和发生后未治疗的患者 Th1 细胞明显增高，治疗后明显下降，而未发生 aGVHD 的患者移植前后 Th1 细胞量变化不大。结论： 发生 aGVHD 患者 Th1 细胞明显增多，且这种增多与 aGVHD 有关。因此，移植后早期动态监测 Th 细胞亚群 Th1 量的变化
3、有助于 aGVHD 的诊治。 【关键词】 急性移植物抗宿主病Quantitative Change of Th Cell Subsets in Patients with Acute GraftversusHost Disease and Its Clinical SignificanceAbstract This study was purposed to investigate the change of Th cell subsets in the patients with acute graftversus host disease （aGVHD） and to explore it
4、s role in the pathogenesis of aGVHD after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation（alloHSCT ）. 23 patients underwent alloHSCT were selected for analysis. The aGVHD in patients was diagnosed according to clinical features, and was confirmed by skin biopsy in some patients. The peripheral bl
5、ood from 23 patients was collected before and after alloHSCT. The quantitative chenges of Th1 and Th2 cells in peripheral blood samples were detected by using flow cytometry. The results showed that out of 23 patieats the aGVHD occured in 8 patients including 1 case of grade , 2 case of grade , 3 ca
6、ses of grade ; no aGVHD occured in 15 patients. The flow cytometry analysis revealed that the amount of Th1 cells in patients with aGVHD was much higher than that in patients without aGVHD （p0.01）, the IFN expression of Th1 cells in patients with aGVHD of grad - significantly was higher than that in
7、 patients without aGVHD (p0.01), meanwhie the IL4 expression 2of Th2 cells in patients with aGVHD of grade - was significantly lower than that in patients without aGVHD (p0.05). Dynamical detection indicated that the Th1 obviously increased before occurrence of aGVHD and before treatment of aGVHD, w
8、hile the Th1 cells obviously decreased after treatment of aGVHD. The Th1 cells not changed significantly in patients without aGVHD before and after alloHSCT. It is concluded that Th1 cells obviously increase in patients with aGVHD, this increase is related to aGVHD pathogenesis. Detecting the change
9、s of Th cell subsets in the early stage after alloHSCT may be contributed to early diagnosis and therapy of aGVHD.Key words acute graftversushost disease; allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; Th1 cell; Th2 cell急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植（alloHSCT ）的主要并发症之一，发生率高达 30%-60%，并造成约 20%的移植相关死
10、亡率，严重影响患者的生存时间和生存质量1 。因此，aGVHD 的发病机理研究是当今移植免疫的重点课题。aGVHD 发生的中心环节是供者来源的 T 细胞识别受者的异体抗原而被激活，过量释放细胞因子而引起受者多器官的损伤。目前临床尚缺乏能够直观，及时反映患者免疫状态变化的手段，因此研究可能引发 aGVHD 的 Th 细胞亚群的变化，对于更好的早期防治 aGVHD 具有重要的实际意义。材料和方法临床资料及研究对象所选择的 23 例异基因造血干细胞移植患者均为 2002 年 2 月至 2004 年 3 月在我院诊治的恶性血液病患者，其中慢性粒细胞白血病 8 例（慢性期 6 例、加速期 2 例） ，急性
11、非淋巴细胞白血病 10 例， （完全缓解 8 例，M5 原发耐药未缓解 1 例，M6 复发 1 例） ，骨髓增生异常综合征 2 例（RA 1 例、RAEBT 1 例） ，急性淋巴细胞白血病完全缓解 2 例 ，淋巴瘤（NHL/ALL）中枢受累 1 例。23 例患者中 21 例接受了异基因外周血干细胞移植，2 例接受了异基因骨髓移植。供受者 HLA 配型均完全相同，同胞供者 21 例，非亲缘供者 2 例（骨髓来自台湾省慈济骨髓库） 。供者外周血造血干细胞动员应用惠尔血 300 g/d，皮下注射，2 次/日，第 5、6 天采集造血干细胞。患者采用经典 Cy+TBI 进行预处理：环磷酰胺60 g/(k
12、gd)，连用 2 天,全身照射 6-10 Gy，分 2 天进行，肺受照剂量8 Gy，2 例接受非血缘关系供者骨髓移植患者采用马利兰+阿糖胞苷+环磷酰胺方案预处理。aGVHD 的诊断及分级参照美国西雅图 Fred Hutchinson 癌症研究中心Thomas 等于 1975 年提出的分级诊断方法。有 7 例患者进行了皮肤活检以取得病理学证据。预防方案：采用环孢霉素（CsA）以及短疗程氨甲喋呤（MTX）方案。MTX 的用法：移植后第 1 天 15 mg/m2 静脉滴注，移植后第 3、6、11 天改为 10 mg/m2； CsA 用法：1.5-2 mg/(kgd)24 小时持续静脉滴注，移植前 1
13、 天至移植后 30 天，每周检查环孢霉素 A 血药浓度，并根据血药浓度调整用药剂量，直至患者无严重胃肠症状后改为口服(3 mg/kg)，依据情况维持或减量。治疗 aGVHD3应用甲基强的松龙 120 mg/d 静脉滴注，好转后改为口服。标本收集按静脉采血常规，定期采集患者的外周血 3 ml，肝素抗凝备检。采血时间分别为：移植前 7 天，移植后第 7、14、21、28 天；移植 1 月后若患者发生aGVHD 随时抽取外周血检查。主要试剂抗人 CD4Pc5(mouse IgG1,13B8.2)购自美国 CoulterImmunotech 公司。抗人 IL4PE(mouse IgG1,8D48) 、
14、抗人 IFNFITC(mouse IgG1,4S.B3),购自美国 BDPharMingen 公司。细胞内细胞因子专用试剂盒（IntraPrepTM Permeabilization Reagent）购自美国 CoulterImmunotech 公司。PMA 和伊能霉素（ionomycin） ；莫能霉素（ monensin）均为美国 Sigma 公司产品。RPMI 1640 培养液为美国 Gibco 公司产品；新生牛血清为美国 HyClone公司产品。 细胞培养与染色取 200 l 抗凝血加入 10 l CD4Pc5 单克隆抗体，室温避光孵育 30 分钟，用 RPMI 1640 培养液洗涤 1
15、 次，将细胞加入 RPMI 1640 培养体系中（含新生牛血清 10%、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 g/ml、PMA 40 ng/ml、 ionomycin 1 g/ml、 monensin 2 mol/L） ， 37、 5% CO2、孵育 18 小时。用 PBS 洗涤 1 次，用 CoulterImmunotech 公司专用细胞内细胞因子试剂（按试剂盒说明书）进行细胞固定、透膜。将细胞分成 2 管，1 管为测定管，同时加入抗人 IL4PE 和 IFNFITC ；另 1 管加入同型对照，室温、避光 30 分钟，用 PBS 洗涤 1 次，待测。流式细胞术测定打开流式细胞仪及氩激光光
16、源（488 nm）预热 20 分钟，仪器自动用标准荧光微球初始校正光路和荧光补偿，然后依次检测标本，每份标本检测 50 000 以上细胞；在前向散射光（FS）和侧向散射光（SSC）散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析 CD4 阳性细胞中 IL4PE 和 IFNFITC 的表达。分析软件为EXPOTM32MultiCOMP 。统计学处理采用 STATA 计算机统计处理系统进行分析，所有数据采用中位数（均数标准差）表示，组间比较采用 2 检验。结 果造血功能重建423 例患者异基因移植后性染色体、ABO 血型、DNA 可变串重复序列检查表明，供者型完全植入，均获得造血功能重建。中性粒细胞恢复到 0.5109/L 及血小板恢复到 20109/L 的中位时间分别为移植后 15（10-23）天及 20（10-66）天。aGVHD 观察23 例患者中发生 aGVHD 共 8 例，其中 3
