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1、1干扰素联合无环鸟苷、维生素 C 治疗单疱病毒性角膜炎的实验研究摘要 目的 通过动物实验研究干扰素（滴宁眼液）联合无环鸟苷眼液、维生素 C 治疗单疱病毒性角膜炎（HSK）的疗效。方法 在 Hep-2（喉癌）细胞上进行单纯疱疹病毒-I 型（HSV-1）接种培养，制作兔 HSK 模型。结果 联合治疗组分别与种毒对照组、无环鸟苷组、干扰素组相比，角膜上皮病变分值差异有显著性（P0.05） ；平均治愈时间：联合治疗组为（10.30.9）天，干扰素组为（13.70.51）天，无环鸟苷组为（13.40.583）天；病理结果：联合治疗组角膜上皮及基质病变程度同期比明显轻于其他 3 组。结论 干扰素与无环鸟苷
2、、维生素 C 联合应用治疗 HSK 能增强药物的抗病毒作用、抑制 HSV 复制、提高机体的免疫力，与单独使用干扰素（滴宁眼液） 、无环鸟苷眼液相比，提高了疗效，缩短了病程，取得了较满意的效果。关键词 干扰素；无环鸟苷；维生素 C；单纯疱疹病毒；角膜炎Study on treating herpes simplex keratitis with interferon，acyclovir and vitamin CAbstract Objective To study the rapeutic effect of IFN and ACV，VitC on eyes of rabbit herpes
3、simplex keratitis (HSK) models.Methods Herpes simplex virusI(HSV1) was propagated and quantitated on Hep2 cells so that rabbit models of HSK could be made.Results Compared with the other groups，the corneal epithelial involvement score of the IFN+ACV+VitC group had remarkable difference. The curative
4、 time： the IFN+ACV+VitC group was (10.30.9) days，the IFN group was (13.70.51) days，and the ACV group was (13.40.583) days.Results of pathological records:The development of cornea disease of IFN combined with ACV，VitC was lighter than that of the other groups.Conclusion The antivirus effect was stro
5、nger when the interferon and acyclovir，vitamin C were used together.The response to treatment of IFN combined with ACV，VitC was better than attained with ACV，IFN alone.The curative time was shorter and the curative effect was better.Key words interferon；acyclovir；vitmit C；herpes simplex virus；kerati
6、tis单纯疱疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK）是常见的危害视力的病毒性眼病，在角膜盲中居首位，多发于青壮年，男女之比为1.521。其特点是多类型、易复发，发病机制与免疫状态有关1 。目前我国每年约进行角膜移植 3000 例（眼） ，其中 HSK 所致的角膜盲占首位2 。本文利用 HSV-1 接种兔角膜建立 HSK 动物模型，研究干扰素（滴宁眼液）联合无环鸟2苷、维生素 C 治疗 HSK 的疗效，以求找出治疗 HSK 有效的药物及方法。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 24 只健康新西兰白兔，体重 1.752.25kg，雌雄不限，双眼无结膜炎、角
7、膜炎等眼部疾病。1.1.2 药品 干扰素（IFN，滴宁眼液）：长春长生基因药业股份有限公司生产。无环鸟苷眼液（ACV）：湖北潜江制药股份有限公司生产。维生素 C 针剂（VitC）：山东新华制药股份有限公司生产。1.1.3 细胞和病毒 Hep-2 细胞：为人喉癌细胞；HSV-1 病毒：为 HSV-1Sm44 株，在 Hep-2 细胞上增殖，TCID50/ml（病毒毒力参数）=1.0106，由山东省医学科学院基础研究所微生物室提供。1.2 方法1.2.1 制作 HSK 动物模型 于接种病毒前 2 天给实验兔双眼滴加 0.25氯霉素眼液，每次 1 滴，每日 3 次。手术前 24 只兔双眼分别用 1%
8、盐酸丁卡因滴眼液滴眼，3min 后再滴 1 次，以麻醉兔眼。用 4.5 号针头作兔角膜上皮层井字划痕，长度 56mm，深度约 0.5mm，吸取 HSV-1 毒株原液 30l 滴入结膜囊，被动闭合兔眼，轻揉 20s。接种病毒 2448h 后，将兔眼用荧光素染色，在裂隙灯下观察角膜感染情况，当兔角膜出现树枝状或地图状病灶时，说明病毒感染成功，动物模型制成。1.2.2 动物分组及治疗方法 24 只兔感染成功后随机分为 4 组，每组各 6只：（1）种毒对照组：不用任何药物治疗。 （2）无环鸟苷组：给予无环鸟苷眼液治疗。方法：每 2h 滴眼 1 次，每次 1 滴，每天 5 次。 （3）干扰素组：给予干扰
9、素（滴宁眼液）点眼，方法同 ACV 组。 （4）联合治疗组：给予干扰素（滴宁眼液）和无环鸟苷眼液交替点眼，给药方法同 ACV 组，2 种眼药水点眼每次间隔10min。每周每只兔球结膜下注射 VitC 30mg 1 次（每眼每次 15mg） ，共 2 次。1.2.3 裂隙灯显微镜观察 每日用荧光素染色后，在裂隙灯下观察兔角膜上皮、基质及前房病变程度，并进行评分。角膜上皮病变评分标准采用 Trousdale记分法3 。Trousdale 计分法是国际通用标准方法，以 1/4 为间隔，即上皮病变面积占整个角膜面积的 25%，即累计 1 分4 。其他评价参数包括：眼睑、结膜、虹膜和房水，其中以角膜上皮
10、病变分值（corneal epithelial involvement score，CEIS）为主要指标。1.2.4 病理切片制作 于接种病毒后第 10 天分别从 4 组兔中随机各取一只兔角膜，经 4%中性甲醛固定液固定、石蜡包埋后，使用 Leicia 2128 组织切片机连续切片，厚度 4m，然后用 HE (苏木精伊红)染色，显微镜下观察。31.3 统计学方法 采用美国 SPSS 研究公司研制的 SPSS11.0 统计软件包中配对样本 T 检验，对结果进行统计学分析。2 结果2.1 裂隙灯显微镜检查 接种病毒后 24h，所有兔角膜上皮均出现点状、棒状浸润病灶。各组兔角膜病变发展程度，见表 1
11、。2.1.1 种毒对照组 角膜病变发展很快，病变程度为各组中最重。与其他 3组相比，CEIS 差异均有非常显著性（P0.01)。接种病毒后第 2 天形成典型树枝状病灶，第 67 天形成大面积地图状溃疡，上皮病变面积以后逐渐缩小、愈合，但基质水肿、浸润明显加重，第 1314 天时形成小圆形溃疡。至病程第 15 天仍有 2 眼角膜浑浊，基质炎症未完全消失。结膜炎发病率为 100%，虹膜炎发病率为 70%，前房积脓及眼睑疱疹发病率均为 30%。至病程第 16 天 5 只兔（10 眼）均未能自愈。表 1 各组不同时期病变程度（CEIS）记录表2.1.2 无环鸟苷组 上皮及基质病变程度较轻，以点状病灶为
12、主，基质水肿、浸润轻微，第 1113 天上皮迅速愈合。与 IFN 组相比，CEIS 差异无显著性（P0.05） 。结膜炎发病率为 80%，虹膜炎发病率为 60%，无前房积脓及眼睑疱疹发生，平均治愈时间为（13.40.583）天。2.1.3 干扰素组 病变程度与无环鸟苷组类似。角膜及结膜病变程度轻、较局限，病变以点状、棒状病灶为主，无明显溃疡形成，病变恢复较快，第 14 天仅个别角膜有点、片状病灶残留。基质病变较轻，为轻度水肿。结膜炎发病率为100%，虹膜炎发病率为 60%，未出现前房积脓及眼睑疱疹。平均治愈时间为（13.70.51）天。2.1.4 联合治疗组 与以上 3 组相比，CEIS 差异
13、均有显著性（P0.05） 。角膜病变程度最轻，以点状病灶为主，基质水肿、浸润较轻微，第 911 天上皮迅速愈合，角膜无溃疡及瘢痕形成。结膜炎发病率为 70%，虹膜炎发病率为30%，无前房积脓及眼睑疱疹发生。平均治愈时间为（10.30.9）天。2.2 病理切片结果 种毒对照组：上皮细胞增大，核大呈椭圆形，基质浅层水肿，有较多浆细胞及少许中性粒细胞浸润；干扰素组：角膜上皮层轻度水肿，上皮细胞增大，基质浅层有部分浆细胞及少许中性粒细胞浸润；无环鸟苷组：角膜上皮轻度水肿，上皮细胞增大，基质浅层有少许炎性细胞浸润；联合治疗组：角膜病变程度较轻，上皮及基质层无明显水肿，上皮层有少许炎性细胞，基质层未见明显
14、炎性细胞浸润。3 讨论4HSV 感染在人群中极为普遍，文献报道，美国每年大约有 40 万人受到 HSV感染，每年估计有 48000 例活动性眼病发作，其中 2 万人为新发病例5 。HSK病情迁延，易反复发作，终使视功能受到严重损害。单独用一种抗病毒药易产生耐药性且复发率较高。有关 T 细胞亚群在原发性致病中的重要性还有争议。在兔眼模型发现，角膜感染后在三叉神经节内有 T 淋巴细胞的存在6 。进一步的研究发现，辅助性 T 细胞 I 型（Th1）CD4+细胞起着更加特异性的作用。无环鸟苷是二代核苷类选择性抗疱疹病毒代表药物，实验证明无环鸟苷更易进入 HSV 感染的细胞，随机被 HSV 诱导的胸腺嘧
15、啶核苷激酶（TK）磷酸化为 ACVMP，在相应酶作用下进一步酸化成 ACVTP，ACVTP 竞争性抑制病毒 DNA 聚合酶，从而抑制病毒 DNA 合成，正常细胞的 TK 不能使 ACV 磷酸化，因而对正常 DNA 聚合酶无作用，不能影响正常细胞7 。目前，无环鸟苷是治疗 HSK 的首选药物，具有作用强、选择性高、毒性少等优点，而且具有良好的眼内穿透性，能透过完整的角膜上皮和基质，在房水中达到一定的治疗浓度。应用无环鸟苷治疗浅层 HSK 疗效已肯定，对深层 HSK 的治疗稍逊8 。干扰素不但可以阻止病毒衣壳蛋白的合成，进一步抑制 HSV 的复制，从而发挥直接抗病毒作用；而且它还有免疫调节作用，可
16、通过调节 T 细胞的免疫功能，加强吞噬细胞活性，提高 NK 细胞的杀伤作用，从而杀灭病毒9，10 。干扰素是目前公认的一种广谱有效的抗病毒药物，是一种高活性、多功能的诱生蛋白，而且能增强一般抗病毒药物的抗病毒能力。维生素 C 是一种水溶性化合物，也是一种重要的自由基清除剂，能参与体内糖代谢氧化还原过程和神经递质的合成，增强机体的抵抗力，维持免疫功能，促进病变的恢复。现已广泛用于治疗某些全身病毒感染，无毒副作用。本组动物每次给予30mg 球结膜下注射，每周 1 次，共 2 次，未见任何不良反应。有学者认为氧自由基参与 HSK 的发生过程，在 HSK 时，角膜组织脂质过氧化物（PG 和12HFTE）明显增高，且其生成量与炎症发生的程度呈正相关。氧自由基不但损害角膜上皮细胞和内皮细胞，而且还吸引吞噬细胞在炎症部位浸润，加大炎症反应，加重角膜的病理损伤11 。而维生素 C 是一种重要的自由基清除剂，在HSK 发生时应用维生素 C 治疗可减
