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1、第四章 基因操作 Gene manipulation,第一节 碱基互补的能力 一、DNA的热变性 1GC含量高的DNA具有较高的熔解温度，可以根据熔解温度的不同将GC含量不同的DNA分子分开，并可推测DNA分子中GC的相对含量。 2根据熔解温度的差别在DNA分子中作基因定位和分离基因。组蛋白是与核DNA结合的碱性蛋白，富含精氨酸，其编码区相对富含GC对。, 海胆组蛋白基因在较底温度时（61）的变性电镜图，每种组蛋白基因被一个富含AT对区域间隔开。用S1核酸酶处理，消除单链。,H1,H2A,H3,H2B,H4,二、互补单链的复性 利用互补单链复性的特点可以确定基因缺失的位置和大小：一个缺失突变体
2、的DNA和一个野生型的DNA一起复性后就可确定缺失区。,a b c d e,a, b, c, d, e,a b d e,a, b, d, e,a b c d e,a, b, c, d, e,a b d e,a, b, d, e,a b,c,d e,a, b, d, e,Heat,Mix and cool,三、染色体上DNA序列的定位 用特异性RNA或DNA作探针与染色体上相应的DNA互补区域作杂交，从而确定该特异性基因的位置称染色体原位杂交（in situ hybridization of chromosome）。,In situ hybridization of human metaphas
3、e chromosomes using fluorescent technique (FISH),第二节 限制性内切酶,一、宿主限制现象,X,X,A,B,X-A,X-B,A,B,B,X-A,X-B,X-B,100%,100%,0.002%,100%,Phage,Infect,Bacteria,从两个不同菌株A和B来的噬菌体X具有不同的感染能力,B,X-B,100%,100%,很差,无法分离到能感染A细菌的X-B来的噬菌体,用很少一些感染力差的,结果说明：噬菌体的宿主范围取决于它所来源的细菌菌株，而不是噬菌体的基因型；宿主的基因型对噬菌体有一种修饰作用，但并不改变噬菌体DNA的序列。细菌的基因型
4、决定该细菌对各种噬菌体感染的敏感性，一种噬菌体的基因型决定它所能感染细菌的范围，它们之间具有密切的依赖和限止关系。 在不同基因型的细菌中生长的噬菌体其具有不同的感染能力,二、DNA的修饰 是什么限制了XB噬菌体在菌株A中的繁殖呢？ 是由于宿主的一种核酸酶的作用，它能将噬菌体DNA切成许多无感染力的片段，宿主细胞具有破坏其陌生DNA的防卫系统。 怎样保护宿主自身的DNA和感染性XA噬菌体DNA免受宿主核酸酶的攻击？ 有一种酶能在特定序列上修饰特异性碱基，但是并不改变这些碱基的编码性质。如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一个甲基后就能保护DNA免受核酸酶的攻击，该过程称甲基化作用（methylation）。
5、,在宿主限制现象中有两个相互的过程： （1）由于宿主核酸酶的作用破坏了侵入的噬菌体DNA，从而限制了噬菌体的繁殖； （2）噬菌体DNA修饰免除了限制酶的作用。 Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not,三、限制酶的特异性 1970年，Hamilton Smith从流感嗜血杆菌d株分离到能识别特定核苷酸序列，切点专一的限制酶HindII 5GTPyPuAC3 3CAPuPyTG5 Smith进一步证明宿主诱导的甲基化作用保护了具有同样序列的DNA免受HindII的切割： m 5GTPyPuAC3 3CAPuPyTG
6、5 m ,*,*,Py：pyrimidine Pu：purine, E.coli的R质粒的一个基因产生的限制酶EcoRI，它对SV40病毒的环状DNA分子上只有一个切点。 5GAATTC3 3CTTAAG5 上述序列是旋转对称的。由于切点是错开的，因此使SV40的环状分子切开成具有粘性末端（sticky ends）的线状分子。 上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保护DNA免受EcoRI的切割。,m,m, 回文序列palindrome 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 EcoRI切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的，称为回文序列palindrome。从正向和反向阅读
7、是同一句子： ABLE WAS I ERE I SAW ELBA,几种限制酶的名称和识别序列,四、限制酶作图 1在DNA分子上确定限制酶切点的相对顺序是一种重要的染色体作图法。从图上任何两个切点之间的距离可估计出核苷酸的数目。 2方法要点：特定来源的DNA经不同的酶消化后，样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到限制位点的图谱。,1 2 3 4 5,5, 3,3, 5,酶 1,酶 2,1 2 3 4 5,32P,32P,酶 1,酶 2,Digestion,1 2,3 4,5,32P,1,2 3,4 5,32P,32P,A,B,C,D,E,F,(a),(b),32P,1 2,3 4,5,1,2,3,
8、4,5,酶 2,A,B,C,1,2 3,4 5,D,E,F,1,2,4,5,酶 1,(a),(b),根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序,亚片段,位于原先片段,1 2 3 4 5,A D A E B E B F C F,(c),3,根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序，可以得到一个DNA的酶切图谱。,1,1 2,2 3,3 4,4 5,5,D,A,E,B,F,C,1 2 3 4 5,2 1 2 1,酶切位点,2 1 2 1,酶切图谱,练习题： 从某一生物的基因组Bam HI文库中获得了长3.0kb的片断,如用EcoRI消化该片断获得1.7kb、0.9kb和0.4kb三种片断;如用Hind 消化获得
9、1.6kb和1.4kb片断;如用上述两酶混合消化获得1.2kb、0.9kb、0.5kb合0.4kb四种片断。根据上述结果绘制限制性图谱。要求标出EcoRI、Hind和BamHI的位点和它们间的距离。,第三节 重组DNA,在细菌细胞中选择性地扩增特定DNA片段的过程称分子克隆（molecular cloning）。,重组DNA技术的基本步骤,（1）获得目的基因，一般是有重要生物学功能的外源基因。 （2）在限制性内切酶和连接酶的作用下，将目的基因与克隆载体相连接，组成一个新的重组DNA分子（recombinant DNA （3）将重组DNA分子引入受体细胞，并在细胞中进行DNA复制，最常用的受体细
10、胞为大肠杆菌。 （4）对转化子（含有重组分子的受体细胞）进行筛选和鉴定，以确认含有外源基因。 大量培养细胞可获得目的基因的大量拷贝，或基因表达的产物等。,一般意义上的重组DNA技术专指在细菌细胞中特异性地扩增特定DNA片段的分子克隆技术，广义上的重组DNA技术还延伸到整个基因工程的应用领域。,重组DNA技术的基本步骤,外源DNA,载体,重组E.coli,目的基因的制备,构建重组DNA分子，首先要获得有用的目的基因片段，最常用的方法有三种： （1）直接从一生物中提取基因组DNA，并构建该基因组的文库（gene library）再从中调出目的基因的克隆。 （2）以mRNA为模板反转录合成互补的DN
11、A，称cDNA，并构建cDNA克隆。 （3）采用聚合酶链反应（PCR）特异性地扩增某一目的基因的片段。,细胞内总DNA的提取和基因文库的构建,各种生物的特定组织（如血液、肝脏、植物组织、细菌细胞等）都含有大分子量的DNA。由于目的基因位于整个基因组DNA中，难以检出和分离，可以先将基因组DNA用内切酶切成较小的片段，再将它们分别与载体相连，并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增，再对各个不同的克隆作出检定。 非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机DNA片段的过程称鸟枪法，全部克隆集合体称某一生物的基因文库。组成一个生物的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了一个生物的整个基因组。,一
12、、直接产生粘性末端用于组成一个新的重组DNA分子（recombinant DNA） 16-2,二、加尾连接（Tailing） 1同聚物加尾 末端转移酶（terminal transferase）能催化DNA的3末端加上核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组质粒，polyG和polyC也可用相同方法加尾。 同聚物加尾连接的优点：加尾后DNA片段自身不会环化，可提高异源DNA重组率。缺点：加入的polyA和polyT可能影响基因表达；外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切出来。,TTAA,AATT,5,3,3,5,5,3,3,5,AAA,AAAA,5,3,5,3,
13、AAA,AAAA,TT TTT,TT TT,AAAA,AAAAA,T TT TT,TT TT,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,5,3,E coRI,外切酶,末端转移酶,dATP,shear,外切酶,末端转移酶,dTTP,TTTT,TTTTT,Plasmid DNA,Drosophila DNA,DNA polymerase,DNA ligase,末端转移酶（terminal transferase）能催化DNA的3末端加上核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组质粒,2人工接头的应用 人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段。 EcoRI C C G
14、 A A T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接头 EcoRI,T4DAN 连接酶,人工接头,EcoRI,外源DNA,粘性末端用于连接载体,人工接头的应用,四、载体Vectors 能使克隆的片段不断复制的一类DNA分子称载体，应具备以下特点： （1）分子量小，核苷酸序列清楚，具有一些单一酶切位点或人工插入的多克隆位点区。 （2）分子中具有一个复制起始点，能使载体自身和插入的外源DNA共同复制。 （3）具有易于筛选重组分子的标志，如抗药性。 (4) 比较容易从宿主细胞中回收,1质粒： 双链环状DNA分子，能经转化导入E.celi中 优点：能使宿主细胞产生抗性，便于选择质粒，在细胞中的拷贝数多。,A color-enhanced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium E.coli.,.The plasmid pUC18 offers several advantages as a
