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1、1尿脱落细胞 Tenascinc mRNA 检测在膀胱癌诊断中的价值【关键词】 膀胱肿瘤；尿脱落细胞；Tenascinc ；逆转录聚合酶链反应(RTPCR)Tenascinc(TNC) 是由单基因编码的细胞外基质糖蛋白分子，主要来源于间质细胞，一些上皮细胞中也能合成，在胚胎时期各种组织中均有广泛的表达，在成熟组织中没有或仅有少量的表达，在多种肿瘤组织中都有突出的表达1。我们通过检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞中 TNC 的表达情况来揭示其在膀胱肿瘤诊断中的价值。1 资料与方法1.1 临床资料 收集膀胱癌患者(均经病理活检确诊)尿液 32 例，男 26 例，女 6 例，年龄 30-79 岁，按 TNM
2、 分期标准 Ta 1 例，T1 14 例，T2 11 例，按WHO 分级标准，G1 12 例，G2 9 例，G3 5 例；前列腺增生症 22 例，年龄 56-76岁，其中合并膀胱炎患者 16 例(诊断标准为尿液分析提示白细胞5 个/HP)；健康志愿者 5 例。1.2 试剂 总 RNA 提取试剂盒和 DNA Marker 购自上海华舜生物工程有限公司，5u/L 的 Taq 聚合酶和 dNTP 混合物(各 10mmol/L)购于大连宝生物工程公司，TNC 引物由上海博亚生物技术有限公司合成，引物设计参照文献2，P1：5TCCTGCTGACTGTCACAATC3 ，P2：5TGCTCACATACAC
3、ATTTGCC3 。1.3 尿液的收取和标本的制备 无菌操作留取每位实验者清晨尿 150mL，其中 100mL 立即离心(4000r/min)沉淀，PBS 液洗涤 2 次再离心后，-70冰箱保存，余下 50mL 作尿细胞学检查。1.4 尿脱落细胞 TNC mRNA 检测 使用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RTPCR) 检测尿脱落细胞 TNC mRNA。各步反应按试剂盒说明进行，随后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在 Gel DOC 1000 紫外检测系统中观察结果并储存图像后进行灰度值测定。1.5
4、尿脱落细胞学检查 将收集的另外 50mL 尿液标本经过离心沉淀后取沉淀物涂片，及时用 100mL/L 乙醇固定后采用苏木素伊红(Hematoxylin and Eosin, HE)染色法，以发现肿瘤细胞为阳性，其余为阴性。1.6 统计学方法 应用 SPSS10.0 软件进行分析。22 结 果2.1 TNC mRNA 检测结果 32 例膀胱癌患者中有 26 例尿脱落细胞中约在250bp 附近检测出 TNC 基因条带(242bp)，阳性率 81.3%，合并膀胱炎的 16 例前列腺增生症患者中有 11 例尿脱落细胞中检测到 TNC 基因表达，特异性为59.3%，健康志愿者未检出该基因的表达(图 1)
5、。图 1 尿脱落细胞的 TNC 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图M：DNA Marker；1：分化级膀胱癌患者；2、8：合并膀胱炎的前列腺增生症患者；3、4、9：分化级膀胱癌患者；5：为分化级膀胱癌患者；6：为浸润性膀胱癌患者；7：为浅表性膀胱癌患者；10：健康志愿者2.2 灰度值 TNC 阳性膀胱炎患者 TNC 平均灰度值低于分化级膀胱癌患者，但差别无统计学意义(P0.05)，膀胱癌患者 TNC 平均灰度值随膀胱癌的分级的增高而升高，各级之间 TNC 平均灰度值存在统计学差异(P0.05，表 1)。浅表性膀胱癌与浸润性膀胱癌患者 TNC 灰度值之间存在统计学差异(P0.05)，而与G2、G3 膀胱癌
6、患者的表达有明显差异(P0.05)。这就提示我们，如果标本量足够，我们就可能设定一表达界值，最大限度地排除假阳性而提高特异性，这对膀胱癌的诊断无疑是有帮助的。另外，对于泌尿系其他肿瘤我们在收集标本时虽然尽量排除，但仍不能完全排除在尿脱落细胞中出现这方面的肿瘤细胞，我们此次研究主要针对泌尿系统中最常见的移行细胞癌，且由于移行细胞癌的预后差异较大，也是我们泌外工作者研究的热点，由于条件所限，我们未能进一步研究其他类型的肿瘤，有待于今后进一步探讨。当然，检测膀胱癌患者尿脱落细胞中 TNC 的表达仅是一初步的研究，它的临床应用价值尚需更多的基础和临床研究以及时间来验证。TNC 作为一种重要的细胞外基质
7、糖蛋白分子，其强大复杂的功能推测是由各片断相对独立的功能共同体现出来的，在今后的研究中若能明确其促进肿瘤细胞浸润和转移的功能域，这对将来应用分子生物学技术来治疗膀胱癌能提供新的思路,TNC 受体的研究也具有重要的理论意义，将为 TNC 复杂多样功能的分子机制研究提供线索,随着对 TNC 的深入研究，其潜在的临床价值必将得到体现，正如 Booth7所说，TNC 可能将成为一种新的膀胱肿瘤诊断工具。【参考文献】1Atula T, Hedstrom J, Finne P, et al. TenascinC expression and its prognostic significance in o
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