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1、Q1：详细陈述植物组织培养与细胞工程大体经历不同阶段，以及每个阶段的代表人物和代表事件。Q2：总结植物组织培养与细胞工程相关的最新研究进展，并举例陈述这门学科在生产生活中的应用。A1：笔记第二页与第三页+以下（一）探索阶段（1902-1929 ）19 世纪 30 年代，细胞学说的确立。1902 年，德国著名植物生理学家 Haberlandt, 首次进行高等植物的细胞培养实验，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。1904 年，Hanning 对萝卜和辣根菜未成熟胚进行培养，离体胚可以充分发育并提早形成小苗。1922 年，Kundson 采用胚培养法获得了兰花幼苗，克服兰花种子发芽困难的问题。1922
2、年，美国的 Robbins 和德国的 Kotte 分别报道了培养离体根尖获得的某些成功。这是有关根培养的最早的实验。1925 年 Laibach 把亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剥出，人工培养至成熟。因此可以认为，幼胚培养和胚胎拯救（embyrorescue）技术是最早应用的植物细胞工程技术。（二）培养技术与理论的建立与发展阶段 （1930-1959）20 世纪 30 年代，植物组织培养技术基本建立。李继侗（1933 年）将 3mm 以上的银杏胚培养成功，并且发现加入胚乳汁可以促进离体胚的成长。1934 年美国的 White 等用番茄的根进行的组织培养，首次建立了活跃生长的无性繁殖系（
3、所用培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖） ；后来（1937）他用三种 B 族维生素（硫胺素、烟酸、吡哆醇 ）取代酵母浸出液获得成功。1934 年，法国 Gautheret 报道了在培养山毛榉、黑杨的形成层时，发现在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的 knop 溶液中，这些组织也可以不断的增殖几个月；但只有在培养基中加入IAA 和 B 族维生素等生长因子，使生长大为增加。1939 年，法国的 Nobecourt 培养胡萝卜根的形成层，也建立了连续生长的组织培养物使离体的植物组织可以在人工培养基上不断生长，从而奠定了现代组织培养的基础。20 世纪 40-50 年代：培养条件和培养基成分的广泛研究4050
4、年代，由于细胞分裂素的发现，从而建立起离体培养器官分化激素配比模式：即激动素生长素的比例是控制芽和根形成的主要因素之一。1958 年，Steward 等人和 Reinert 等以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了 Haberlandt 的关于细胞全能性的设想。（三）快速发展和实践应用阶段(1960 年以后)1960 年 Cocking 等用真菌的纤维素酶，从番茄幼根中分离得原生质体。Okata（1962 年）发现仙台病毒（Sendal virus）可诱发艾氏腹水瘤细胞融合，形成多核细胞，为动物细胞融合技术的发展奠定了基础。诺贝尔医学和生理学奖获得者 Cesar Milstein和 Geoger
5、Kohler（1975 年）将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，获得了既能在体外无限繁殖，又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，有力的促进了免疫学的发展。1971 年 Takebe 等从烟草叶肉细胞分离得原生质体，并培养成完整的植株。1972 年 Carlson 对 2 个种的烟草原生质体进行了融合培养，并成功获得第一个体细胞杂交的杂种植株。19641966 年，Guha 和 Maheshwari，在毛曼陀罗花粉培养中，诱导未成熟花粉形成单倍体。1976 年，San Noeum 培养普通小麦的未授粉子房，获得了雌性单倍体植株。1973 年，Srivastava 等从罗氏核实木胚乳培养中，获得
6、了三倍体植株细胞工程技术发展迅速，试管植物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世。以色列用胚胎干细胞培养出人类心脏组织，可以正常跳动，以及美国培养的造血先驱细胞、中国培养的胃和肠粘膜组织等。1977 年英国利用胚胎工程技术成功地培养出世界首例试管婴儿，1997 年英国首次克隆出绵羊“多莉”，2001 年英国又培育出首批转基因猪。细胞工程的发展历史细胞工程的理论基础是细胞学说和细胞全能性学说。1839 年，Schwann 和 Schleiden建立了细胞学说，细胞学研究进入快速发展阶段。德国学者 Haberlandt（1902 年）在发表的植物细胞立体培养实验的论文中提出了细胞全能性的观点。H&
7、auml;nning（1904 年）进行了幼胚的立体培养，在含有糖、无机盐、氨基酸和植物提取物的培养基上，培养萝卜和辣根菜的幼胚，发现离体幼胚均可充分发育，并且可以提前萌发成苗。1925 年，Laibach 培养亚麻种间杂交幼胚获得成功，并得到杂交种。从 20 世纪 20 年代起，幼胚培养被用来挽救远缘杂交早期败育的胚胎，因此可以认为，幼胚培养和胚胎拯救（embyrorescue）技术是最早应用的植物细胞工程技术。20 世纪 30 年代，植物组织培养技术基本建立。李继侗（1933 年）将 3mm 以上的银杏胚培养成功，并且发现加入胚乳汁可以促进离体胚的成长。1937 年，White 发现 B
8、族维生素、吲哚乙酸对植物生长具有促进作用。19371939 年，White、Gautheret 和 Nobercourt分别建立了植物组织的连续培养物，使离体的植物组织可以在人工培养基上不断生长，从而奠定了现代组织培养的基础。20 世纪 60 年代初，Cocking 等人用纤维素酶来分离植物原生质体并获得成功。分离得到的原生质体在培养过程中，可长出新壁，进行分裂和分化，最终形成完整植株。获得成功的植物有胡萝卜、矮牵牛、油菜、石刁柏等。在动物学界，1907 年美国生物学家哈里森用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织，存活数周，而且观察到细胞生长现象，开创了动物细胞培养的先河。德国胚胎学家 Spemamm（
9、1938 年）认为，早期胚胎细胞具有高度的分化潜能，将胚胎的细胞核移植到去核卵母细胞中，可以发育为新的胚胎。Briggs 和 Kings（1952 年）把非洲豹蛙囊胚的细胞核一到去核的卵母细胞中，得到了非洲豹蛙的胚胎克隆后代，从而证实了 Spemamm 的观点。Okata（1962 年）发现仙台病毒（Sendal virus）可诱发艾氏腹水瘤细胞融合，形成多核细胞，为动物细胞融合技术的发展奠定了基础。诺贝尔医学和生理学奖获得者 Cesar Milstein 和 Geoger Kohler（1975 年）将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，获得了既能在体外无限繁殖，又能产生特异性抗体的杂
10、交瘤细胞，有力的促进了免疫学的发展。细胞工程技术发展迅速，试管植物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世。以色列用胚胎干细胞培养出人类心脏组织，可以正常跳动，以及美国培养的造血先驱细胞、中国培养的胃和肠粘膜组织等。1977 年英国利用胚胎工程技术成功地培养出世界首例试管婴儿，1997 年英国首次克隆出绵羊“多莉”，2001 年英国又培育出首批转基因猪。Q2 研究进展细胞工程在植物方面的应用微繁殖技术（Micropropagation）的应用微繁殖技术，即以植物的器官、组织、细胞或原生质体为外植体，在离体培养条件下进行植株再生的技术。应用微繁殖技术既可用于克服高度杂合物种因有性繁殖而引起的后代严
11、重分离，如澳大利亚的番木瓜；有可用于名优或濒危物种的快速繁殖，如凤梨、草莓。通过微繁技术已获再生植株的树种主要有番木瓜、柑橘、龙眼、荔枝、苹果、梨、葡萄等，草莓、香蕉等以实现了商品化生产。通过茎尖培养或微嫁接技术，可以脱去植物体内的病毒，获得无病毒苗木，如苹果、草莓等。另外，在组织培养过程中，如愈伤组织培养、细胞悬浮培养、原生质体培养等，通过pH 值、温度、离子浓度等条件的变化，可增加其变异，从中可筛选出优良的突变体，从而为新品种的选育开辟一条崭新的途径。愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等是基因转化的良好受体材料，并且在离体培养条件下进行植株再生也是实现植物遗传转化的重要环节。此外，微繁技术为种质
12、的保存（germplasm storage）提供了新方法。很多种质资源在离体培养条件下，通过减缓生长和低温处理而达到长期保存目的，并可进行不同国家、地区间的种质资源收集、互换、保存和应用，即建立“基因银行”（gene bank） ，实现种质资源的全球共享。例如，在比利时 Catholic University 的 Leuven 研究中心有大量离体保存的香蕉种质库。细胞大量培养与有用次生代谢产物生产细胞大量培养有用次生代谢产物是植物细胞工程另一个重要应用领域。通过细胞工程技术，刺激植物体内某些重要次生代谢产物的合成和积累，然后进行分离、提纯，如某些名贵药物、香精、色素等，实现植物产品的工业化生产
13、。早在 1964 年我国就开始进行人参细胞培养。1980 年以后，我国研究者相继开展了紫草、三七、红豆杉、青蒿、红景天和水母雪莲等植物的细胞大量培养和研究，并利用生物反应器进行药用植物的细胞大量培养的小试和中试。其中新疆紫草中试的规模达到 100L，并小批量生产了紫草素，用于研制化妆品及抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物。红豆杉细胞大量培养在我国也获得初步成功，从细胞培养物中得到了珍贵的抗癌药物紫杉醇，但产率还有待提高。单倍体（Haploid）技术的应用单倍体育种和相关研究在农业和园艺植物中得到了广泛的应用。用 Blakeslee 等（1922 年）和 Kostoff（1941 年）分别得到了单倍体植株
14、单倍体有利于突变的检测和抗性细胞系的筛选，并且大大缩短了育种的时间。此外单倍体在基因图谱、基因转移研究中具有重要作用。自然形成的单倍体是极少见的，并且仅限于几种植物。花药培养是单倍体形成的重要途径。自 1964 年第一例花药培养获得成功以来，花药培养技术已取得了显著的进展，尤其在水稻、小麦、玉米等作物中已获得巨大成功。现已取得成功的果树树种主要有番荔枝（Nair 等，1983 年） 、番木瓜（Litz 和 Conover，1978 年） 、4 个柑橘品种（Chen，1985 年） 、龙眼（Yang 和 Wei，1984 年） 、荔枝（Fu 和 Tang，1983 年） 、苹果（Zhang 等，
15、1990 年） 、梨（Jordan，1975 年） 、葡萄（Rajasekaran 和 Mullins，1979 年）等。薛光荣等（1980 年）对东方草莓（四倍体）的单核期花粉进行培养，成功的诱导出单倍体植株。花药培养主要是受基因型、花药的发育阶段、预处理和培养条件的影响，其存在的主要问题是单倍体的诱导频率低，单倍体自发加倍形成的二倍体与体细胞组织形成的二倍体很难区分。例如，Fowler 等（1971 年） 、Nishi 等（1974 年）和 Rosati 等（1975 年）以八倍体草莓花药为材料诱导愈伤组织，并分化出植株，发现其再生植株仍为八倍体，这些八倍体是由无性器官发育而来，还是由单倍
16、体自发加倍而成则难以区分。除花药培养外，植物的卵细胞、助细胞、反足细胞等单倍体细胞通过离体培养可以分化成单倍体胚或愈伤组织。胚珠、子房培养也曾进行了大量尝试，但大多数情况下，在愈伤组织阶段生长停止。胚培养（Embryo culture）胚的离体培养是直接应用于植物改良最早的组织培养技术。胚培养可以克服杂交后胚的衰亡，保证种内或种间杂交的成功，或用于无性繁殖困难的植物的培养。胚培养还可以克服种子的休眠和败育。Magdalita 等（1996 年）和 Drew 等（1997 年）分别进行了番木瓜的种内杂交，得到合适的胚子后，进行了胚培养，以促进杂交成功。Jordan（1992 年）得到了愈伤组织，但未得到再生植株。澳大利亚国际农业技术研究中心对番木瓜和其野生种的杂交胚进行了培养研究，已获成功，并得到了杂交后代，野生种的抗性、高含糖量等优良性状得到了遗传。荔枝是较难进行离体培养的果树树种之一，Kantharajah 等（1992 年）培养了长度为 3mm 的荔枝幼胚。其他通过未成熟胚培养进行再生的树种有鳄梨、番荔枝和番木瓜等。姚强（19
