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1、1.2基因工程的基本操作程序,一.教学目标,1.简述基因工程原理及基本操作程序 2.尝试设计某一转基因生物的研制过程,二.教学重点和难点,1.教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤 2.教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因,基因工程基本操作的四个步骤：,获取目的基因,构建基因表达载体,导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,教学过程,得到转基因生物,第一步,第二步,第三步,第四步,一、目的基因的获取,1、什么是目的基因？ 目的基因:主要是指编码蛋白质的基因，或调控作用的 因子。 生物抗逆性相关基因 优良品质相关基因 生物药物和保健品相关的基因 毒物降解相关基
2、因 工业所需用酶相关的基因 也可以是一些具有调控作用的因子,阅读与思考,获取目的基因的常用方法,从基因文库中直接获 如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进 行PCR技术扩增 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,2、获取目的基因的方法有哪些？ 其操作过程分别是怎样的？,从基因文库获取目的基因,基因文库：将含有某种生物不同基因的DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,b.部分基因文库（cDNA文库）,a.基因组文库,a:基因组文库,a.基因组文库：是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机
3、械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,B：部分基因文库,b.部分基因文库（cDNA文库）：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。,mRNA,单链DNA,双链DNA,如何从基因文库中找到所需要的基因？,依据目的基因相关信息,依据目的基因的有关信息,基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因表达产物蛋白质等特性
4、。,从基因文库中获取目的基因的方法,两种基因文库的主要区别,利用PCR扩增目的基因,a:PCR的全称：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） b:PCR的原理：生物体外复制特定 DNA片段 C:PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列,d:利用PCR扩增目的基因,1过程,高温变性(90-95解旋为单链）,低温退火（55-60引物与单链互补结合）,适温延伸（70-75在Taq酶的作用下 合成与模板互补的DNA双链）,重复循环多次,2、条件,已知基因的核苷酸序列、,四种脱氧核苷酸、,两种引物,TaqDNA聚合酶、,使目的基因的片段在短时间
5、内成百万倍地扩增,4、结果,3、方式：以指数方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,2n,适宜的温度和PH值,通过DNA合成仪 用化学方法直接人工合成,如果基因较小，核苷酸序列已知，可以利 用DNA合成仪人工合成,二、基因表达载体的构建,为什么要构建基因表达载体？,1基因表达载体的构建目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代， 同时使目的基因能够表达和发挥作用,阅读与思考,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们的作用各是什么？,复制原点：DNA复制的起点 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断， 它是RNA聚合酶识别和结合的部位，
6、有了它才能驱 动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 目的基因：主要是指编码蛋白质的基因 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,3 、构建过程,受体细胞不同（植物 动物、微生物）基因 表达载体的构建有所 差别,基因表达载体构建模式图,三、将目的基因导入受体细胞,1、什么是转化？ 2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？ 3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？,阅读与思考,1转化：,目
7、的基因进入受体细胞内，并且在 受体细胞内维持稳定和表达的过程。,2：将目的基因导入植物细胞,a:农杆菌转化法 农杆菌的特点: .易感染双子叶植物和祼子植物。 .具有趋化性。 .Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上,转化过程,b:基因枪法,又成微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在 金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基 因与其整合并表达的方法。这是单子叶植物中常用的一种 基因转化方法。,c:花粉管通道法,在植物授粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前， 减去柱头；然后，滴加DNA（含目的基因）， 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,显微注
8、射法：将基因表达载体提纯，用显微注射仪注射到受精卵中,3、导入动物细胞,显微注射技术-转基因超级小鼠,体型比普通小鼠大1.8倍,体型比普通小鼠大1.8倍,体型比普通小鼠大1.8倍,体型比普通小鼠大1.8倍,体型比普通小鼠大1.8倍,体型比普通小鼠大1.8倍,显微注射技术操作程序：,a.先提纯含目的基因的表达载体 b.从动物体内取出卵(受精卵） c.显微注射仪进行显微注射 d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体,4、导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、 单细胞、遗传物质相对较少,首先用Ca2+处理细胞 感受态细胞 重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 在一定的温度下感受态细
9、胞吸收DNA分子完成转化过程,方法：大肠杆菌细胞常用的转化方法,大肠杆菌,首先用Ca2+处理细胞 感受态细胞 重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 在一定的温度下感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程,首先用Ca2+处理细胞 感受态细胞 重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 在一定的温度下感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程,首先用Ca2+处理细胞 感受态细胞 重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 在一定的温度下感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程,首先用Ca2+处理细胞 感受态细胞 重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合 在一定的温度下感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程,四、目的基因的
10、检测与鉴定,阅读与思考,1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？ 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？,1、分子水平的检测：分子杂交技术,检测是否插入目的基因,检测是否转录出mRNA,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素 做标记作为探针，与基因组DNA杂交,用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交,DNA分子杂交技术,目的基因的检测示意图,检测目的基因是否翻译成蛋白质,从转基因生物中提取蛋白质， 用相应的抗体进行抗原-抗体杂交， 看是否出现杂交带。,2、个体水平的鉴定,抗虫鉴定 抗病的鉴
11、定 活性鉴定,DNA基因探针 DNA分子杂交,用放射性同位素等作标记的含有 目的基因的DNA片段称为基因探针。,放射性同位素标记基因,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,抗体抗原杂交检测的原理,指抗原与相应抗体之间 所发生的特异性结合反应。 这种反应即可在机体内进 行，也可以在机体外进行。 抗原抗体反应的过程是经 过一系列的化学和物理变 化，包括抗原抗体特异性 结合和非特异性促凝聚两 个阶段，以及由亲水胶体 转为疏水
12、胶体的变化。,抗原抗体反应曲线,抗体抗原反应,思考与探究？,1 作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务 吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用, 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,2 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，若要生产人的糖蛋白 可以用大肠杆菌吗？,蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和 高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在 于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，大肠 杆菌不能生产人的糖蛋白。,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测
13、与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、化学方法人工合成,复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、 显微注射法、Ca2+处理法,DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术个体水平鉴定,小 结,课堂检测,1基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,2：有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的
14、形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,3：在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 ( ) A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因 C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因,4.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌 ( ) A.能进行DNA复制 B.能传递给细菌后代 C.能合成生长抑制素释放因子 D.能合成人的生长素,5人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是 ( ) A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.有利于对目的基因是否导入进行检测 C.增加质粒分子的分子量 D.便于与外源基因连接,参考答案,C D C C B,
