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1、1重组蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤的实验研究作者：马艳王力焦东晓王淑芬【摘要】 目的 探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物氟尿嘧啶(5-FU)联合应用治疗结肠癌的效果,以期探索结肠癌治疗新途径。方法 结肠癌 SW-480细胞(1107/只)注射到 30只裸鼠皮下,建立结肠癌皮下移植瘤模型。当肿瘤长至 23 mm时,随机分 6组。给药途径均为腹腔注射给药。治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小。 疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD31 免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度(MVD)。结果 各试验组肿瘤的生长明显受到抑制，瘤体质量明显低于对照组(
2、P001)。5-FU+Canstatin 组低、高浓度联合治疗组抑瘤作用较对照组明显增强(P005)，其瘤重抑制率分别为 7476%和 8204%。免疫组化：5-FU +Canstatin组低浓度组(22636)和 5-FU +Canstatin组高浓度组(15028)治疗小鼠肿瘤组织内 MVD显著低于对照组(36456)和 5-FU治疗组(31240)(P005),而 5-FU治疗组与对照组间差异无统计学意义;不良反应：各实验组未观察到明显毒性反应。结论 重组人Canstatin蛋白能有效抑制人结肠癌生长,无明显毒副作用,为结肠癌治疗提供了新的有力的治疗方法。 【关键词】结肠癌；血管生成；血
3、管生成抑制剂；Canstatin 蛋白 【Abstract】 Objective To study the anti-tumor effects of recombinant canstatin protein plus 5-fluorouracil(5-FU)on colon cancer in order to develop a new treatment modality.Methods Tumor xenografts were established by subcutaneous inoculation of 1107 SW-480 colon cancer cells into
4、 the right flanks of 30 nude mice.When the tumors reached 23 mm in diameter,mice were randomly divided into 6 groups.All the agents were injected intraperitoneally.During the treatment,the subcutaneous tumors were measured by compasses and caliper every 3 or 4 days.At the end of the experiment,all t
5、he tumors were resected and both routine pathological and immunohistochemical staining examinations were performed to observe the drug toxicity and intratumoral microvescular density(MVD).Results In every treatment group tumor growth was suppressed significantly.Intraperitoneal injection of canstati
6、n low-dose group,canstatin high-dose group,5-FU group,5-FU group+ low-dose canstatin group,5-FU group+ high-dose canstatin group resulted in a significant inhibition of the growth of SW-480 in vivo compare with that of control group(P005).The anti-tumor effect of canstatin plus 5-FU was significantl
7、y suppressed the tumor growth.At the end of the experiment,the size of tumors in combination group was the lowest(P005),with the highest tumor suppression rate of 7476% and 8204%. The immunohistochemical examination showed that the MVD5-FU group +canstatin low-dose 2group(22636)、5-FU group +canstati
8、n high-dose group(15028)was significantly lower than that in NS group(36456)or 5-FU group(31240)(P005).No significant difference was found in MVD between 5-FU and control groups.During treatment,no obvious toxicity was observed.Conclusion Recombinant human canstatin protein effectively retards the g
9、rowth of colon cancer through inhibiting the angiogenesis of tumors,without remarkable adverse effects.Synergic anti-tumor effect is achieved as canstatin is combined with cytotoxic drugs. 【Key words】Colon cancer;Angiogenesis;Angiogenesis inhibitors;Canstatin protein 结肠癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，全球流行病学调查结果显示
10、，大肠癌的发病率居肺癌、乳腺癌之后占第三位，近年各地资料显示其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着人们的健康与生命1,2。随着分子生物学的发展,利用DNA重组和基因转移技术的结肠癌基因治疗成为极有发展前景的治疗方法。在迄今发现的的多种抗肿瘤药物中,血管生成抑制剂以其显著的抗肿瘤效果吸引了众多的研究,Canstatin 是继血管抑素和内皮抑素后新发现的一种内源性血管生成抑制剂3-6。 体内外实验表明,Canstatin 具有抑制新生血管生成，抑制异种移植人前列腺癌和人肾癌的生长的作用,疗效甚至强于内皮抑素,引起人们普遍关注。但是,Canstatin 对人结肠癌的作用如何,尚未见报道,其与传统化疗药物
11、联合应用的疗效亦有待阐明。笔者在既往研究中,成功克隆了 Canstatin基因7,并表达出活性重组人 Canstatin蛋白,在此基础上,笔者探讨了 Canstatin蛋白联合化疗药物 5-FU治疗结肠癌的疗效,旨在探索结肠癌治疗新途径。 1 材料和方法 11 试验动物、细胞株、药品及试剂 SPF级 BALB/c裸鼠 30只,4 周龄,体质量 1618 g,购自中国药品生物制品检定所(合格证：京质字 0052997)。SW-480结肠癌细胞系购于美国 ATCC公司,南京凯基公司提供,单层贴壁生长,集落形成率为 40%,裸鼠致瘤性为 100%。5-FU 购自江苏南通精华制药有限公司,CD31 抗
12、体购自北京中杉金桥生物公司。 12 动物模型的建立 将已培养好基本长满瓶壁的 SW-480结肠癌细胞弃培养瓶内培养基，用平衡盐溶液(PBS)冲洗培养瓶 2次，加入体积分数为 025 的胰蛋白酶数滴消化，将消化好的细胞吸入离心管内，600 转/min 的离心机离心 6 min，弃上清，加入不含小牛血清的 RPMI-1640培养基 3 ml，吸管吹打混匀(取适量计数细胞)再离心，弃上清，按每只裸鼠皮下接种细胞数251019/L ，再加入无血清 RPMI-1640培养基，供裸鼠皮下接种用。准备好的 SW-480细胞悬液经台盼蓝染色活细胞数占 095 以上，按每只 02 ml SW-480细胞悬液注射
13、于消毒后的裸鼠皮下，观察肿瘤移植成功率。 13 试验分组 30只小鼠皮下移植处均成瘤，接种 4 d后随机分成 6组(每组 5只)。对照组(生理盐水 03 ml/kg)；Canstatin 低剂量组(1 mg/kg，用药 3周)；Canstatin 高剂量组(10 mg/kg，用药 3周)；5-FU 组(5-FU 125 mg/kg，用药 5 d)；联合 5-FU+Canstatin低浓度治疗组(5-FU 125 mg/kg，用药 5 d加 Canstatin 1 mg/kg，用药 3周)；联合 5-FU+Canstatin3高浓度治疗组(5-FU 125 mg/kg，用药 5 d加 Canst
14、atin 10 mg/kg，用药 3周)，以上组别均采用隔天腹腔注射给药，疗程 3周。 14 观察指标和方法 用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤长短经。按通用公式V(mm3)=长宽20 52计算肿瘤体积 V。计算瘤重抑制率，瘤重抑制率/%=1-(试验组平均瘤重/对照组平均瘤重) 100%。合并用药效果根据文献8提供的金氏公式求出 q值进行判断。q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb)，Ea+b 为两药合用的抑制率，Ea 和 Eb为各药单用的抑制率，若 q085 说明二药合用有拮抗作用，若 085115 说明二药合用有协同作用。动物实验结束裸鼠采用颈椎脱臼法处死。 15 光镜观察及免疫组化 无菌条件下
15、取出肿瘤组织,称重,以 40 g/L甲醛固定。 为观察药物毒性反应,同时取出实验动物的心、肝、胃、胰腺、肠等组织以 40 g/L甲醛固定。免疫组化染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法。镜下微血管计数分级方法参照 Wender等9的方法，先在低倍光镜下(40 倍)确定肿瘤内新生血管最密集区作为“热点” ，进行血管计数，然后在高倍镜视野(200 倍)计数 5个视野，每个视野的血管平均数为该切片的 MVD值。 16 统计学方法 计数资料数据采用均数标准差(xs)表示,采用 SPSS 130 软件，单向方差分析(One-way ANOVA)进行样本均数间多重比较，两两比较用非配对 t检验。 2 结果
16、 21 裸鼠体内成瘤情况 自接种后第 5天，所有裸鼠均可见接种部位小结节，约 5 mm5 mm大小，随后结节逐渐增大，至第 10天，约 7 mm 7 mm。42 只裸鼠全部成瘤，成瘤率达 100%。 22 各组药物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 试验结束后，各用药组瘤质量及瘤体积明显低于对照组(P001)，联合 5-FU+Canstatin低浓度治疗组和联合 5-FU+Canstatin高浓度治疗组移瘤作用进一步增强，抑瘤率分别为7476%，8204%，结果见图 1,表 1。 23 各组药物对裸小鼠毒性的影响 用药期间，各治疗组小鼠均未逐渐出现精神不振、食欲下降、消瘦等表现，未见明显不良反应。疗程结束时,Canstatin治疗组和 5-FU治疗组与对照组相比较,小鼠体
