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1、几种 HE 染色方法比较摘 要：HE 是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）的首个字母缩写。苏木精是碱性染料，使细胞核染色质和胞质内的核糖体呈紫蓝色。伊红是酸性染料，使细胞质和细胞外基质中带较强碱基的蛋白质成份着红色。通过本实验掌握石蜡切片 HE 染色技术，探讨一种适合动物材料的最佳 HE 染色方法。我们分别用不同固定液固定兔颈总动脉，用不同 HE 染色方法染色，比较不同方法的效果。染色结果是细胞核与细胞浆呈蓝红相映，色泽比较鲜艳。改良 Harris 法染色效果最好，染色效果受组织病理变化情况影响，有个体差异。关键词：HE 染色；改良 Harris 法；改良 Lillie-Ma
2、yers 法；改良 Mayer 法；1 引言在病理学实验课中，要观察大体标本和镜下标本，为了能更好的掌握实验课中所学的知识和内容，尤其是镜下标本，熟悉病理组织的制片技术是非常重要的，这对能否看好切片有很大帮助，它是教学、医疗、科研中必不可少的重要组成部分。染色原理和机制尚无定论，处于学说阶段。可能既是化学反应，又有物理作用参加。从化学角度看，动物或植物细胞内，一般有酸性和碱性部分的区分。含有酸性物质的部分能与溶液中的阳离子结合，含有碱性物质的部分能与溶液中的阴离子结合。例如细胞核，特别是核内的染色质，一般认为是酸性物质组成的，其中主要是核酸，故它与碱性染料的亲和力很强，易于染色，例如氧化苏木素
3、铬盐因为碱性燃料中的碱性部分有染色作用的是阳离子，而细胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料的亲和力很大易于染上它的颜色，如伊红，因为是酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子，所以细胞核为碱性染料苏木素所染，细胞浆为酸性染料伊红所染。细胞内核的染色质、粘液和软骨的基质多染碱性染料。但必须注意的是，嗜碱性和嗜酸性是相对的而不是绝对的，若细胞在盐基性染液内置留过久，胞浆也可着上盐基性染料的颜色。相反，若细胞浆在酸性染液内置留过久，胞核也能着色。从物理角度看，在染色过程中，染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内，此时，因受到分子的引力作用，色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和
4、不同的吸附程度，因此就可显出来不同的颜色来。本实验主要针对常规 HE 染色方法的不足，从固定剂的特性、用量、染色剂用量和染色方法、染色条件等几个方面加以调整和改良，找出效果比较理想的切片染色方法。实验采用苦味酸和福尔马林两种方法来固定，改良 Harris 法、改良 Mayer 法、改良 Lillie-Mayer三种 HE 染色方法, 两种伊红染液（0.7%酸化伊红和 0.5%水溶性伊红染液）进行实验。2 材料及方法2.1 实验材料 新西兰大白兔两只，分别为 2.8kg 和 2.7kg。2.2 主要试剂 70%酒精，80%酒精，95%酒精，无水酒精，蒸馏水，苦味酸，苏木素，硫酸铝钾，红色氧化汞，
5、冰醋酸，甘油，碘酸钠，钾明矾，浓盐酸，碳酸氢钠，硫酸镁，二甲苯（固定液），伊红 Y ，1%稀氨水，浓度为 10的甲醛固定液，石蜡，试剂均为分析纯。2.3 用品与仪器 烧杯（1000ml 100ml 50ml），量筒（1000ml 10ml），漏斗，滤纸，玻璃棒，移液管，洗耳球，载玻片，盖玻片，滴管，镊子，解剖刀，标签纸等。仪器见表 1所示。表 1 主要仪器型号表仪器名称 型号 制造厂家切片机 OPJ-1B 天津天利航空机电有限公司电子天平 sartorius 北京赛多利斯仪器系统有限公司倒置显微镜 OLYMPUS IX71 日本进口恒温箱 HH.B 上海跃进医疗器械厂水浴锅 DZKW-4 北京
6、中兴伟业仪器有限公司电炉 DL-1 北京光明医疗仪器厂2.4 实验方法 将新西兰大白兔通过注射空气致死后，进行颈部解剖手术分别取其左右颈总动脉，用苦味酸和福尔马林两种方法来固定，并进行改良 Harris 法、改良 Mayer 法、改良 Lillie-Mayer三种 HE 染色方法的改良实验，最后用倒置显微镜进行镜检观察分析。3 实验步骤流程实验的具体方案见表 2：表 2 HE 染色实验方案第一组 第二组苦味酸固定法 中性福尔马林固定法苏木素染色方法不同 苏木素染色方法不同改良的 Harris法改良 Lillie-Mayers 法 改良迈耶法改良的 Harris法改良 Lillie-Mayers
7、 法 Gill 法分别对三种方法采用两种伊红染色：07% 酸化伊红法0.5%水溶或醇溶性伊红染液分别对三种方法采用两种伊红染色：07% 酸化伊红法0.5%水溶或醇溶性伊红染液3.1 组织的取材与固定 取材是根据实验的目的和要求以及病变的程度而合理取得的组织材料。取材的正确与否直接影响到病理诊断的结果。固定是将需保留制成标本的脏器或病变组织，浸入固定液内，使组织的形态结构与生前相仿，组织细胞的物质成分变为不溶性，从而得到保存。同时使组织硬化，利于切片；使组织产生不同的折光率便于观察；某些固定液有助染作用，利于切片染色。组织取材应注意以下几点：l）及早取材，愈新鲜愈好；2）取材刀要锋利，宜一刀切平
8、；3）活体小块组织要包好，以免丢失；4）为区别脏器的不同部位可将组织分别切成不同形状（三角形、方形、梯形等）；5）取材后要标记检验号，以防混乱造成差错；取材后剩余组织应保留，以便复检、特染、教学和科研之用。3.1.1 固定液的配制1、饱和苦味酸溶液（共配 200ml）：100ml 蒸馏水中加入苦味酸约 1.5 克，制成饱和水溶液。2、0.1mol/LPBS 缓冲液：19mlA 液和 81mlB 液混合再加至 200ml 即为 0.1mol/L 缓冲液：A 液： 3.12g，至 100ml 蒸馏水B 液：N HP 12 O 7.16g，至 100ml 蒸馏水3、10%中性福尔马林固定液（共配 2
9、00ml）：10ml 甲醛加入 90ml 浓度为 01mol/L PBS3.1.2 手术取材将两只大耳兔进行注射空气法致死后，进行颈部解剖手术分别取其左右颈总动脉，用苦味酸和福尔马林两种方法来固定。固定过程中用摇床振荡，大约 12 小时。其手术情况见图 1和图 2，取材实验记录见表 3。图 1 手术前实验准备图 2 颈总动脉取材过程中表 3 取材及固定记录表兔（重量 kg） 动脉类型（左/ 右） 体内长度（cm） 体外长度（cm） 固定方法左（L ） 7.0 5.0 苦味酸第一只（2.8 ）右（R ） 7.0 4.7 福尔马林左（L ） 7.5 5.0 苦味酸第二只（2.7 ）右（R ） 7.
10、5 5.0 福尔马林3.2 脱水及透明 脱水是应用脱水剂将组织内的水分置换出来，以使石蜡均匀地渗透到组织中，同时组织又不出现收缩变形等人工改变。我们选择酒精为脱水剂：脱水力较强，因为浓度高时易使组织过度硬化，所以一般从低浓度开始，逐渐递增其浓度，直至无水酒精。透明是组织经脱水后，用能与脱水剂及石蜡混合的试剂，将脱水剂置换出来，使石蜡均匀渗透进去，有的透明剂可使组织呈透明状态，故称透明。二甲苯既溶于酒精又溶解石蜡，我们选择其作为透明剂。3.2.1 溶液配制75%乙醇 400ml85%乙醇 400ml95%乙醇 800ml1:1 的无水乙醇二甲苯 400ml3.2.2 脱水步骤 首先用流水冲洗固定
11、后的组织 30min，开始以下脱水步骤：75%乙醇（2h） 85%乙醇（2h）95%乙醇（2h）95%乙醇（2h）100%乙醇（2h）100%乙醇 （2h）3.2.3 透明步骤11 无水乙醇二甲苯（30min）二甲苯（30min）二甲苯（30min）3.3 浸蜡及包埋浸蜡是组织经透明后，置入熔化的石蜡中浸渗，约为 1 小时，共三次。浸蜡的目的是将石蜡均匀浸渗至组织中，使组织的硬度与石蜡的硬度相似，利于切片。浸蜡后的组织用包埋框将其包埋。包埋用蜡的熔点（47.5 ）要与最后一次侵蜡的石蜡熔点相一致，这样有利于切片。3.4 切片、粘片及烤片 切片是将组织标本制成很薄的片子，以便染色后，在显微镜下能
12、观察细胞的形态结构和病变情况，是制片中的重要一环。切片方法是：将切片用具备好，修正并固定好包埋蜡块，即可切片。切片厚度一般为 6m 左右（本实验因切片机问题选择 810m），将切出的片子放在水浴锅中展开，然后用粘片剂粘在预先用酒精处理了的载波片上，经过 37.5恒温箱中烤片 2h 后即可进入染色。3.5 HE 染色程序 染色是组织标本制成切片后，为了观察和鉴别其形态结构或物质成分有无异常，用适当的染料进行染色。组织不同着色不同，深浅不一。苏木素本身无染色能力，必须在媒染剂的作用下经氧化为苏木红才具有染色作用，用于细胞核染色。伊红 Y 用于细胞浆染色。还可显示细胞的嗜酸性颗粒，故将这种细胞颗粒称
13、嗜伊红颗粒。3.5.1 染液的配制1、改良的 Harris 苏木素液：200mlA 液：苏木素 1g 无水酒精 10mlB 液：硫酸铝钾 20g 蒸馏水 200ml步骤：两液分别溶解后混合，加热煮沸后，徐徐加入红色氧化汞 0.5g，此时有大量气泡产生，故容器宜大，以防液体溢出，然后将染液迅速冷却，过滤后每 100ml 加入冰醋酸6ml，并加入甘油（丙三醇）10ml。2、改良 Lillie-Mayers 苏木素苏木素 0.25g，无水酒精 2ml，硫酸铝钾 0.5g，蒸馏水 33ml，碘酸钠 25mg，甘油 15ml，冰醋酸 1ml3、改良的 Mayer 苏木素染液A 液：苏木素 1g 无水酒精
14、 20mlB 液：钾明矾 50g 蒸馏水 300mlAB 两液分别溶解后混合，煮沸 3-5 分钟加入蒸馏水至 1000ml，最后再加入 0.2g 碘酸钠。4、0.7%酸化伊红染液伊红 Y4g，蒸馏水 100ml，95%酒精 200ml。取伊红 Y4g，溶于 100ml 蒸馏水内，加浓盐酸2ml，用玻棒搅拌均匀，使其变黄沉淀，放置 24 小时后，用滤纸过滤，待液体全部滤净，再取蒸馏水 10ml，置入滤过容器内冲洗滤出物。连续冲洗 3 次，将滤出物连同滤纸一起放入 60干燥箱内烘干，将烘干的滤出物溶于 95%酒精 200ml 内，制成酸化伊红饱和溶液，室温存放备用。用时取饱和溶液 1 份加上 95
15、%酒精 2 份，配制成 0.7%酸化伊红酒精染液。5、0.5%水溶性伊红染液取伊红 Y0.5g，蒸馏水 100ml。先用 20ml 蒸馏水溶解伊红，全部溶解后加入全部 80ml 蒸馏水。最后加一滴冰醋酸。6、1%盐酸-酒精分化液浓盐酸 0.5ml，70%酒精 45.5ml7、Scott 促蓝液碳酸氢钠 0.35g，硫酸镁 2g，蒸馏水 100ml8、1%稀氨水9、25%氨水 20ml，470ml 蒸馏水10、80%乙醇3.5.2 脱蜡处理二甲苯（3 次，每次 10min）100%酒精（3 次，每次 5min）95%酒精（1 次，10min）80%酒精（1 次，10min）蒸馏水（2 次，每次 5min）3.5.3 开始染色处理苏木素染色（12min）Scott 促蓝液冲洗（1min）1%盐酸酒精分化（20s）Scott 促蓝液洗（1min）1%稀氨水返蓝（30s） Scott 促蓝液洗（1min）用 0.7%酸化伊红染液和 0.5%水溶性伊红染液分别染色（30s）自来水冲洗后立即进行以下处理：80%酒精（5min）95%酒精（5min）100%酒精（2 次，每次 5min）染好的切片放在载玻片盒里暂时储存，以便后面镜检观察。3.6 进行镜检学习使用倒置显微镜后，在镜下逐渐放大观察，并对较好的染色片子进行显微拍照。
