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1、鱼类线粒体基因组研究进展,姓名：,研究背景,线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器，它含有自己的DNA，具有相对独立的遗传系统。它是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。,鱼类线粒体基因组,线粒体DNA是Nass等在1962年发现的。之后，1992年台湾学者Tzeng等发表了台湾缨口鳅线粒体DNA全序列，这在鱼类是首次。 截止到2004年已测定161种鱼类线粒体DNA全序列，它们的分子量在15.219.8Kb之间。（除海七鳃鳗、淡水七鳃鳗和溪鳉外,其余158种鱼mtDNA的结构和基因
2、成分都与其他脊椎动物的类似,鱼类线粒体DNA基因组结构示意图 （西田，1998）,37 个编码基因,22个tRNAs,2个rRNA基因：(12SrRNA和16SrRNA),控制区(D环区),轻链复制起始区,13 个疏水蛋白基因,细胞色素b(Cyt b),2个ATP酶的亚单(ATPase8和ATPase6),3个细胞色素c(Cyt c)氧化酶的亚单位(CO、和),7个NADH还原酶复合体的亚单位(ND-1、-2、-3、-4、-4L、-5和-6),鱼 类 线 粒 体 DNA,结构特点,提取方法,研究进展,应用前景,研究内容,遗传特点,检测分析,一、鱼类mtDNA的遗传特点,mtDNA通常为母性遗传
3、,这种传递方式是由于成熟的卵母细胞所含的mtDNA较精子中的mtDNA高几千倍。该遗传方式便于进行群体分析,只需少量个体便能反应群体遗传结构。,mtDNA进化主要以碱基替换为主,插入和缺失较少;碱基替换主要发生在基因间隔区和控制区,且不同部位替换速率不同。 mtDNA进化速率较核DNA快510倍,其原因主要有: (1)选择压力小; (2)受诱变的影响大;(3)代谢增补时间短;(4)复制无校对修复,1、分子较小且存在长度多态性:鱼类mtDNA分子大小范围一般在15-19kp之间，约占总DNA的1。鱼类mtDNA的分子大小在种间存在差异，但这种长度差异并非源于基因数目，主要由于串联重复序列的存在。
4、 2、编码效率高:同核DNA相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，基因间隔常少于10bp,且无内含子，编码效率较高。此外,部分mtDNA的密码子不同于基因组DNA，且缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。 3、拷贝数多:鱼类每个细胞中有100010000个线粒体DNA拷贝，容易从组织中分离纯化。 4、进化速度快:鱼类mtDNA的突变率高于核中DNA，为基因组DNA的5一10倍，并且缺乏有效的DNA损伤修复机制，修复效率低。,二、鱼类mtDNA的结构特点,5、解码体系简单:鱼类mtDNA的解码由一个很小的tRNA体系完成，而不像在核基因组摆动假说中所要求的需要在32个tRNA反密码子上的摆动。 6、
5、遗传的相对独立性:mtDNA能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tDNA)和核糖体RNA(rRNA),也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA编码蛋白质和一些小的RNA，特别是tRNA来实现的 。 7、同质性与异质性:一般情况下，在一种生物机体内仅存在一种类型的mtDNA分子，但现在大量发现一些个体存在多种类型mtDNA分子，这种特性被称mtDNA分子的异质性。 8 、多态性:mtDNA中存在多态现象多态性集中在D环，其他区域则高度保守一。 9、母系遗传:
6、mtDNA一般不发生重组，随细胞质进行。但鳗鱼线粒体为双亲遗传,三、鱼类mtDNA的提取方法,（1）直接从鱼类组织提取线粒体DNA 从肌肉、肝脏等组织中提取线粒体DNA 。其中碱变性法是常见的实验方法，主要溶液是STE液：10 mmol NaC1，15 mmol Tris-HC1(pH8.0)，45 mmol EDTA(pH8.0)，0.25 mol蔗糖。把提取的线粒体DNA放入一20保存备用。该方法获得的是鱼类的整个mtDNA分子。 一般肝细胞、胃壁细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多，直接提取mtDNA获得纯度很高的mtDNA用于研究要选取这些组织，必须杀死鱼才能得到，研究存在数量多的鱼类可以
7、采用该法。 （2）先提取基因组DNA再用相应引物PCR 扩增所需mtDNA某一区域序列片段。,四、鱼类mtDNA的检测分析,目前用于鱼类mtDNA多态性的检测方法主要有以下几种： （1）、内切酶图谱法：一般用双酶消化构建鱼类mtDNA限制酶图谱。内切酶图谱法是一种较早的研究方法,此法虽在检测点突变上较为直观,但费时且须做双酶切,其谱带亦较复杂,若个体出现多态就更难解释。 （2）、标准RFLP：其研究步骤为：mtDNA样品一RE消化一电泳一结果检测。该法适合于分析样品中靶序列含量相对较高的样品，如mtDNA和PCR扩增产物，还可进行位点比较和片段长度比较。 （3）、PCRRFLP法：从细胞总DN
8、A中，用设计的引物扩增mtDNA某一序列，RE消化，溴化乙锭染色，电泳检测。这一技术不仅可直接酶切小于5002 000 bp的短小片段，还避免了纯化mtDNA的繁琐工作。,（4）、探针法：又称杂交法。将基因组DNA酶切，用mtDNA探针进行South杂交来识别DNA上的mtDNA谱带，通过自显影检测印迹。 （5）、PCR-SSCP:是PCR技术和SSCP技术的结合产物经过变性后进行单链DNA凝胶电泳时每一条单链处于一定的位置,靶DNA中若发生碱基缺失插入或单个碱基置换时就会出现泳动变位从而揭示该片段有基因变异的存在 。 （6）、测序法：直接测定mtDNA的全序列或特定片段的序列。这种方法可获得
9、大量直接可靠的数据。（目前，一般测序公司采用测序的原理是双脱氧链终止法）,五、鱼类mtDNA研究进展,（一）、鱼类全序列mtDNA研究,曹萤等使用6种酶对尼罗非鲫和奥利亚非鲫的mtDNA进行RFLP分析,测得两种鱼mtDNA都约为16. 83kb,并认为Pvu可作为鉴别两种鱼类的限制性内切酶,（二）、鱼类mtDNA编码区各片段的研究,1、细胞色素b(Cyt-b)基因片段,田燚等对六个鲫鱼品系进行了线粒体Cytb基因PCR-RFLP分析利用5种限制性内切酶对细胞色素b基因进行酶切，结果显示供检测到4种组合单倍型，野鲫和黑龙睛的遗传距离为0，高背鲫与彭泽鲫的为0，野鲫与红鲫为0.00039。得到的
10、结果为鲫鱼群体内的多态性比较贫乏。,2、ATPase8、ATPase6,刘良国等运用PCR扩增、克隆、测序等技术对五种鲫鱼品系的线粒体DNA ATPase8、ATPase6的基因序列的碱基组成、变异情况和分子系统进化进行了比较分析发现红鲫和普通鲫关系较近，洞庭青鲫和彭泽鲫关系较近，而他们与日本白鲫关系较远，因此推测红鲫、洞庭青鲫和彭泽鲫均起源于普通鲫。 3、NADH降解酶基因 (1)姚纪花等对我国6个地区银鲫的mtDNA2ND5/ 6片段进行了RFLP分析,共获得11种图谱和7种限制性类型,根据各群体间的遗传距离构建了UPGMA聚类关系图,探讨了银鲫6个种群间的遗传关系。,（2）庄怡等人采用P
11、CR -RFLP方法分析鲫鱼不同品系mtDNA ND3/ND4L /ND4 基因片段，对鲫鱼6个不同品系的基因片段进行测序。首次提出异育银鲫和浙江地区野鲫（河鲫鱼）在mtDNA ND3/ND4L/ND4 基因上的分子鉴定法。,4、细胞色素c基因片段,大量研究表明，物种内的COI 基因的序列分歧很少有大于2%的, 大部分的种内分歧小于1%。程磊等人利用鱼类的DNA条形码研究了线粒体细胞色素c 氧化酶亚基I ( COI )基因5 端651 bp 的片段在这些种和亚种（共计 128 尾标本）中的变异。得到的结论为：金鱼起源于中国南方的鲫而不是银鲫，以及发现某些单倍型是二倍体与三倍体共享的，所以倍性也
12、不宜作为种的划分标准, 简单的将三倍体视为独立的种或者亚种并不恰当。,（三）、鱼类mtDNA非编码区各片段基因研究进展,鱼类mtDNA非编码区包含两段,一段是控制区(control region) ,另一段是L-链复制起始区。,1、mtDNA控制区结构研究：控制区又称D-环区 ,位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间,是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域,但其中也包含有保守片段。 因此常常作为线粒体mtDNA遗传分析基因片段，例如：朱雪莲等人借助mtDNA控制区序列分析金鱼与不同地域鲫的亲缘关系。刘琳等人应用PCR技术对行两性生殖的天津子牙河42尾二倍体野生鲫鱼群体mtDNA的D-lo
13、op区段进行扩增，结果显示：个体间不存在长度变异现象,控制区包括,H链复制起始区：OH 终止结合序列区：TAS 保守序列区：CSB L-链启动子：LSP H-链启动子：HSP,（1）、H链复制起始区：OH,包含与DNA复制终止相关的序列TAS,拷贝数在l8个之间,mtDNA长度变异的主要原因。 目前郭新红1等人识别了不同倍性鲤科鱼中的ETAS 为TACATAT-ATGTATTATCACCAT-TATATTAACCA- 郭新红等人在研究不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的结构时发现红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤含有4个TACAT核心序列,日本白鲫中含有3个TACAT核心序列,三倍体湘云鲤含有1个TAC
14、AT核心序列,而已有报道的斑马鱼中含有6个TACAT核心序列。,（2）、中央保守区,郭新红等人识别了不同倍性鲤科鱼类mtDNA控制区的中央保守区的CSB-F(关键为:ATGTAG-GAG ACCACC) ,CSB-E(关键序列为:ATG-AT-GAATCA-GGACA-) ,CSB-D(关键序列为:TTAT-CTGG-ATCTG-T-AA),（3）、保守序列区,郭新红等人识别了不同倍性鲤科鱼类的CSB1(一般形式为:ATT-AATTAATG-T-GCAGGACA-TA) ,CSB2(一般形式为:CAAA-CCC CCCTACCCCC) ,CSB3(一般形式为: TGTCAAACCCGAAA C
15、CA),2、L-链复制起始区,L-链复制起始区(OL)长约3050bp,位于L-链tRNAAsp和tRNACys基因间。富含G-C对,而环的碱基组成、长度变异比较大。5-GCCGG-3是OL中RNA引物与DNA合成的转换区,位于H-链OL茎区5端,其序列组成和位置从人、海豹、果蝇到鲤鱼、泥鳅、 虹鳟都是十分保守的。,六、鱼类mtDNA应用前景,1、群体遗传结构分析 例如：周建峰等运用PCR-RFLP方法分析了鲤鱼3个亚种线粒体DNA的ND5/ 6区段来了解它们之间的遗传关系,找到了区分鲤鱼3个亚种的线粒体DNA分子遗传标记 2、类群识别 例如：多态性丰富的 mtDNA可作为类群识别的标志。Ba
16、rlett 等【5】利用 Cyt b基因的 307bp 序列，成功地区别了加拿大东海岸的 4 种有重要商业价值的金枪鱼，为保护处于濒危状态的蓝鳍金枪鱼提供了技术支持。Murakami等分析了 169 尾鲫鱼的 D-loop 序列，共检出 37 个单倍型，它们构成了 3 个主要的群体，其中白鲫的两个单倍型自成一个群体，支持了传统形态分类学将白鲫定位为鲫鱼的一个亚种的论断。,3、类群的地理分化 例如：Durand等对62种鲤科鱼的线粒体Cyt b基因的遗传变异进行分析,阐明中东是淡水鱼种形成的交界地 4、类群的起源分化、扩散 例如：Liu等利用mtDNA控制区序列变异探讨了鲤科鱼的系统发育关系。,谢谢观赏,
