单细胞测序

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1、第4章-3 单细胞测序 1 1）什么是单细胞测序？）什么是单细胞测序？ 2 2）为什么要单细胞测序？）为什么要单细胞测序？ 3 3）单细胞测序的方法）单细胞测序的方法 4 4）单细胞测序的问题）单细胞测序的问题 5 5）展望）展望 单细胞测序 单细胞测序单细胞测序（single cell single cell sequencingsequencing），），简称简称SCS,SCS,系指从系指从 单个细胞提取单个细胞提取DNADNA或或RNARNA样品进行样品进行 DNADNA或或RNARNA的测序。的测序。 单细胞测序进展年表 Molecular Cell 58, 2015 单细胞测序 在生

2、物学和医学研究中的应用-1 单细胞测序有广泛的应用领域：单细胞测序有广泛的应用领域：1 1）神经生物学）神经生物学根据转录物组来确定神经细胞根据转录物组来确定神经细胞 的类型。的类型。2 2）生殖遗传）生殖遗传人类单个精子测序发现，每个精子细胞平均发生人类单个精子测序发现，每个精子细胞平均发生 22.822.8个重组事件，个重组事件，5 5- -1515个基因转换事件，个基因转换事件，2525- -3636个新突变。个新突变。3 3）器官发生）器官发生传传 统的方法是依据少数标记来确定细胞的类型，而单细胞统的方法是依据少数标记来确定细胞的类型，而单细胞RNARNA测序可提供同一测序可提供同一

3、类型细胞的转录物组组成。类型细胞的转录物组组成。4 4）癌症生物学）癌症生物学肿瘤细胞在增殖过程中会发生肿瘤细胞在增殖过程中会发生 新的突变，形成遗传异质性亚群体。单细胞新的突变，形成遗传异质性亚群体。单细胞DNADNA和和RNARNA测序可揭示异质性肿瘤测序可揭示异质性肿瘤 细胞的基因型组成，为肿瘤的发生，微进化及医疗诊断和治疗提供理论依据。细胞的基因型组成，为肿瘤的发生，微进化及医疗诊断和治疗提供理论依据。 5 5）医学诊断）医学诊断血细胞遗传变异检测等。血细胞遗传变异检测等。Molecular Cell 58 , May 21, 2015 单细胞测序 在生物学和医学研究中的应用-2 单细

4、胞测序有广泛的应用领域：单细胞测序有广泛的应用领域：1 1）免疫学）免疫学体内免疫系统会产生大量的免疫体内免疫系统会产生大量的免疫 细胞类型。从小鼠细胞类型。从小鼠脾脏响应抗原脾脏响应抗原LPS激活的激活的40 00个单细胞个单细胞RNA测序揭示，测序揭示， 存在存在7类不同的细胞类群，发生了类不同的细胞类群，发生了1 575个不同的基因应答。个不同的基因应答。2）微生物学）微生物学 环境中的微生物有环境中的微生物有99%是不能实验室培养的，古细菌单细胞是不能实验室培养的，古细菌单细胞DNA和和RNA测测 序发现了生命之树中序发现了生命之树中29个以往未涉及的物种，对生命三域提出了挑战。个以往

5、未涉及的物种，对生命三域提出了挑战。3） 组织嵌合性组织嵌合性 在一类神经细胞中发现在一类神经细胞中发现13%41%的细胞存在基因组的细胞存在基因组CNV（拷（拷 贝数变异）。贝数变异）。4）胚胎学）胚胎学 单细胞单细胞RNA测序发现在卵裂球细胞中检测到测序发现在卵裂球细胞中检测到1 000 个异质性转录产物。个异质性转录产物。5）产前诊断）产前诊断 可在卵裂球和子宫植入前对胚胎进行单可在卵裂球和子宫植入前对胚胎进行单 细胞检测，及早发现遗传隐患。细胞检测，及早发现遗传隐患。 Molecular Cell 58 , May 21, 2015 肿瘤细胞遗传异质性 单细胞 基因组 测序 - 宏基因

6、 组学 研究 宏基因组学的研究必须从环境中收集共生混杂的微生物，然后提取总宏基因组学的研究必须从环境中收集共生混杂的微生物，然后提取总DNADNA。在构。在构 建建DNADNA文库进行高通量测序后，获得的文库进行高通量测序后，获得的DNADNA序列经比对组装。虽然依据序列经比对组装。虽然依据16 16 rRNArRNA序列可区分环境中微生物的物种组成，但不能区分其它序列可区分环境中微生物的物种组成，但不能区分其它DNADNA序列的归属。序列的归属。 单细胞测序可以解决上述问题。单细胞提取的单细胞测序可以解决上述问题。单细胞提取的DNADNA经经MDAMDA扩放后，可构建单细胞扩放后，可构建单细

7、胞 基因组测序库，高通量测序后的序列可组装，产生单一基因组序列。基因组测序库，高通量测序后的序列可组装，产生单一基因组序列。 单细胞基因组测序 - 癌变基因组学研究 肿瘤细胞产生后，有一个继续发肿瘤细胞产生后，有一个继续发 展的过程。由于初始肿瘤细胞展的过程。由于初始肿瘤细胞 增殖后，会在某些个体细胞中增殖后，会在某些个体细胞中 发生新的突变并形成新的细胞发生新的突变并形成新的细胞 系。这一过程可能在后续的肿系。这一过程可能在后续的肿 瘤增生时反复出现，形成具有瘤增生时反复出现，形成具有 遗传异质型的肿瘤细胞群体。遗传异质型的肿瘤细胞群体。 右图显示，在初始肿瘤突变细胞右图显示，在初始肿瘤突变

8、细胞 M1M1增殖后，到取样时肿瘤细胞增殖后，到取样时肿瘤细胞 中已发生了中已发生了8 8次突变。由于细胞次突变。由于细胞 增殖和细胞之间的竞争，增殖和细胞之间的竞争，肿瘤肿瘤 样品细胞群体中不同克隆系含样品细胞群体中不同克隆系含 有的突变基因存在差异。有的突变基因存在差异。 Molecular Cell 58, May 21, 2015 单细胞测序-程序与方法 单细胞测序涉及单细胞测序涉及3 3个步骤：个步骤：1 1）从细胞群落或组织中分离高质量的有代表性的单）从细胞群落或组织中分离高质量的有代表性的单 细胞；细胞；2 2）从单细胞中提取和扩放全基因组）从单细胞中提取和扩放全基因组DNADN

9、A或转录产物；或转录产物；3 3）进行全基因）进行全基因 组范围的组范围的DNADNA或转录组测序。或转录组测序。 丰度单细胞的分离 表中所列为丰度单细胞的提取方法及其优缺点和每种方法表中所列为丰度单细胞的提取方法及其优缺点和每种方法 的实验耗费。的实验耗费。Molecular Cell 58, May 21, 2015 罕 见 单 细 胞 的 分 离 表中所列为罕见单细胞的提取方法及其优缺点和每种方法表中所列为罕见单细胞的提取方法及其优缺点和每种方法 的实验耗费。的实验耗费。Molecular Cell 58, May 21, 2015 常 用 的 单 细 胞 分 离 技 术 图示图示5 5

10、种常用的单细胞分离技术与方法种常用的单细胞分离技术与方法 Int. J. Mol. Sci. 16：16897-16919，2015 常用 单细 胞分 离技 术的 应用 状况 Int. J. Mol. Sci. 16：16897-16919，2015 流 式 细 胞 仪 激 光 激 活 分 拣 流式细胞仪的发流式细胞仪的发 明已有很长的历明已有很长的历 史。图示制备的史。图示制备的 携带不同标记的携带不同标记的 细胞悬浮液样品细胞悬浮液样品 进入一个进入一个60100 um的管道，在压的管道，在压 力液流的作用下，力液流的作用下， 细胞液流形成极细胞液流形成极 微小单个液滴，微小单个液滴， 并

11、依次通过激光并依次通过激光 检测仪。使用电检测仪。使用电 极板作用微滴，极板作用微滴， 使其产生流向偏使其产生流向偏 转进入收集管转进入收集管。 FACS-Aria III 系统每秒可产生系统每秒可产生 100 000100 000个个微滴，微滴， 分析分析70 000事件。事件。 激光切割单细胞技术 a) a) 在激光切割分开单细胞后，利用接触使粘帽黏取单细胞。在激光切割分开单细胞后，利用接触使粘帽黏取单细胞。b)b)切离切离 单细胞后，利用重力作用驱使细胞转移到试管。单细胞后，利用重力作用驱使细胞转移到试管。c)c)利用激光脉冲利用激光脉冲 使切离的单细胞进入收集微管。使切离的单细胞进入收

12、集微管。 微流分离单细胞技术 悬浮于水溶液中的细胞微流进入油相液体形成微滴，每个微滴含一悬浮于水溶液中的细胞微流进入油相液体形成微滴，每个微滴含一 个细胞（个细胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA106：1419514200，2009）b)b) 一个薄膜气压阀门可以在气压作用下开关，在开放时单细胞进一个薄膜气压阀门可以在气压作用下开关，在开放时单细胞进 入微管，使单细胞分离（入微管，使单细胞分离（Anal. Chem. 79：85578563，2007）。）。 c)c)利用流体动力学，使细胞微流流经适合单细胞的流体动力学利用流体动力学，使细胞微流流经适合单细胞的流体动力学

13、陷阱并使其留驻分离（陷阱并使其留驻分离（ Lab Chip 6： 2006, 6, 14451449 ）。）。 单细胞 基因组 测序 - DNA扩放 单细胞测序的关键步骤是，如何将提取的单细胞极微量的单细胞测序的关键步骤是，如何将提取的单细胞极微量的DNADNA样品扩放到足以进样品扩放到足以进 行行DNADNA建库的数量。图中是已经报道的建库的数量。图中是已经报道的3 3种单细胞种单细胞DNADNA扩放的方法：扩放的方法：a a）纯）纯PCRPCR 扩放会丢失许多不处在合成互补引物内的序列；扩放会丢失许多不处在合成互补引物内的序列；b b）等温扩放（）等温扩放（MDAMDA）存在扩）存在扩 放

14、的偏好性，产生非均一扩放；放的偏好性，产生非均一扩放；c)c)杂交扩放具中间覆盖度，一致性较好。杂交扩放具中间覆盖度，一致性较好。 Nature Review Genetics 17: 175-188, 2016 单细胞 WGA - WTA 单细胞基因单细胞基因 组扩放组扩放(WGA)(WGA) 和转录物组和转录物组 扩放扩放(WTA)(WTA) 的程序与方的程序与方 法。不同的法。不同的 扩放产生的扩放产生的 DNADNA片段长片段长 度相差很大，度相差很大， 影响覆盖面。影响覆盖面。 单细胞单细胞DNA扩放扩放酶酶-Phi29 在单细胞在单细胞DNADNA测序中，由于起始测序中，由于起始D

15、NADNA量非常少，必须解决单细胞量非常少，必须解决单细胞DNADNA大大 量扩增的问题：量扩增的问题：1 1）单细胞）单细胞DNADNA测序对保真度要求非常高；测序对保真度要求非常高；2 2）因起）因起 始始DNADNA量非常少，必须大量扩放才可达到实验要求。量非常少，必须大量扩放才可达到实验要求。 为了克服上述问题，单细胞为了克服上述问题，单细胞DNADNA测序采用来自测序采用来自枯草杆菌噬菌体枯草杆菌噬菌体Phi29 的的 DNA聚合酶聚合酶(Phi29) ，原因在于，原因在于: 1) Phi29 具有具有高加工性能高加工性能，可产生大于，可产生大于70 kb的扩放的扩放DNA。 2)

16、Phi29 具有很高的具有很高的保真度保真度，它的，它的35校读能力可使复制校读能力可使复制差错率差错率 保持在保持在1/106107碱基碱基。 3) Phi29遇到下一个引物时，遇到下一个引物时， 可将前面已合成的可将前面已合成的DNA单链推开继单链推开继 续延伸合成，不必解链，因而可在等温条件下续延伸合成，不必解链，因而可在等温条件下(30OC)完成反应。完成反应。 4) 由于由于Phi29 可将前面已合成的可将前面已合成的DNA单链推开，推开的单链又可单链推开，推开的单链又可 与引物结合起始新链合成，因而称为与引物结合起始新链合成，因而称为多次取代扩放（多次取代扩放（ Multiple Displacement Amplification，MDA ）。 Molecular Cell 16：609618，2004 Phi29 DNA Pol的复制特点的复制特点 Phi29 DNA Phi29 DNA PolPol 复制噬菌体基复制噬菌体基 因组有因组有3 3个特个特 点：点：1 1）以）以DNADNA 末端结合蛋白末